His肽修饰的人干扰素γ的研制

1His肽修饰的人干扰素γ的研制胡大强(第三军医大学大坪医院野战外科研究所药剂科，重庆400042)提要：目的为了便于人干扰素γ功能研究，制备6His修饰的人干扰素γ。方法采用一步反向PCR扩增编码人干扰素γ的cDNA序列,克隆到质粒pUC19,测序鉴定正确后构建到pQE80L表达质粒中，经BamHI和HindIII双酶切后，行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定；利用SDS-PAGE和Westernblot检测表达的目的蛋白,Ni2+-NTA柱纯化蛋白，酶联免疫吸附测定纯化的目的蛋白。结果一步反向PCR扩增得到编码人干扰素γcDNA片段，测序结果正确,SDS-PAGE和Westernblot分析显示His修饰的人干扰素γ在大肠杆菌中获得了高效表达,SDS-PAGE证实目的蛋白具有较高纯度，酶联免疫吸附测定显示目的蛋白具有高的生物活性。结论成功制备了6His肽修饰的人干扰素γ。关键词：干扰素γ；表达；蛋白纯化Keywords:humaninterferongamma;expession;proteinpurification人干扰素γ（Humaninterferongamma,huINFγ）具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用[1]，临床上广泛使用。但在huINFγ的功能研究中，常需要对huINFγ进行定性或定量，一般使用huINFγ的单抗，采用酶联免疫法来定性或定量。His肽单抗作为成熟产品，实验室已常规使用，制备6His修饰的人干扰素γ不需其单抗，采用His肽单抗即可对其定性或定量，有助于干扰素γ的研究工作。本文采用基因工程技术，把6His肽结合到人干扰素γ的N端上，制备6His修饰的人干扰素γ。1材料与方法1.1质粒和菌株pUC19、pQE80L质粒和DH5α菌株，由本实验组保存。1.2试剂和仪器TripureRNA提取试剂为Roche公司产品，限制性内切酶BamHI和HindIII,DNA聚合酶，T4连接酶购自大连宝生物公司。PT-PCR试剂盒为美国Promga公司产品，质粒提取试剂盒、DNA片段胶回收和PCR产物回收试剂盒为美国Omega公司产品，引物由上海生工公司合成，抗-His单抗和Ni2+-NTA层析系统购自德国Qiagen公司，异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)为美国sigma公司产品，卡介菌多糖核酸注射液为湖南斯奇生物制药有限公司产品。1.3引物的设计合成为得到实验所需目的片段,我们设计了扩增去掉信号肽的huIFNγ引物。上、下游引物分别选用BamHI和HindIII两个酶切位点，引物序列如下：上游引物：5’-gtggatcccaggacccatatgtaaaag-3’，下游引物：5’-ggcaagcttttactgggatgctcttc。1.4人单个核细胞（pBMC）总RNA提取首次接受卡介菌多糖核酸注射液用药的病人，im36h后，取静脉血10mL到预先加入肝素0.2mL的离心管中,采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，再提取pBMC总RNA。有关操作依照RNA提取试剂盒说明操作,所得总RNA保存在70%乙醇中于-70℃储存。1.5PT-PCR反应扩增编码huIFNγ片段采用PT-PCR技术扩增出编码huIFNγcDNA片段。PT-PCR反应以pBMC总RNA为模板。循环条件：45℃反转录45min；94℃2min激活热启动TaqDNA聚合酶；以cDNA第一链为模板,94℃30s,57℃1min,68℃2min,共进行35个循环；最后68℃延伸7min。回收RT-PCR产物2中的目的片段,经BamHI和HindIII双酶切,0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳后胶回收huIFNγ片段，构建在pUC19上，转化感受态DH5α细菌，蓝白斑筛选，挑选白斑单克隆接种培养后,小量法提取质粒,进行双酶切鉴定，送阳性重组质粒细菌测序。1.6pQE80L/huIFNγ表达载体的构建将测序正确的重组pUC19/huIFNγ质粒经小量法提取,经BamHI和HindIII双酶切后琼脂糖电泳胶回收huIFNγ片段,构建到pQE80L载体上。再转化感受态DH5α细菌,氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化单克隆接种培养后,小量法提取质粒,进行双酶切鉴定阳性克隆。1.7蛋白的诱导表达挑取含重组原核表达载体的单个菌落接种于LB培养液中,37℃,225r.min-1振荡培养过夜,次日以1%接种到5mLLB培养液中,37℃,振荡培养至A600为0.6时,加IPTG至终浓度为1mmoL.L-1,继续培养4h。1.8SDS-PAGE参照《现代分子生物学实验技术》进行[2],以15%的聚丙烯酰胺为分离胶,浓缩胶浓度为5%,取上述培养液1mL,离心10000g,1min,沉淀加100μL1×上样缓冲液,100℃煮10min,取20μL上样,电泳后,行考马斯亮蓝染色。1.9Westernblot分析经诱导的pQE80L/huIFNγ/DH5α工程菌行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后,将凝胶上的蛋白半干法电转移至硝酸纤维素膜上,丽春红S染色后标出marker的位置,去离子水洗去膜上的丽春红S,5%脱脂奶粉室温封闭,加抗His单抗孵育,洗涤后加HRP标记的第二抗体室温孵育1h,洗膜后加DAB闭光显色。1.10Ni2+-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白将含重组质粒pQE80L/huIFNγ的表达菌在500mlLB中扩增培养(方法同1.7),离心收集菌体,超声碎菌,离心沉淀得包涵体,用缓冲液A(8mol/L尿素、0.1mol/L磷酸二氢钠、0.01mol/LTris-HClpH8.0)裂解,裂解上清过Ni2+-NTA层析柱,依次用缓冲液A和缓冲液B(8mol.L-1尿素、0.1mol.L-1磷酸二氢钠、0.01mol.L–1Tris-HClpH6.3)洗柱,直至A280小于0.001,用缓冲液C(缓冲液B中含0.25mmol.L-1咪唑)洗脱目的蛋白，采取逐步降低尿素浓度的方法,透析除去纯化蛋白溶液中的尿素,使变性蛋白在此过程中自然复性,冻干得到huIFNγ，行SDS-PAGE分析制备蛋白纯度。1.11ELISA检测huIFNγ称取制备的huIFNγ适量，用PBS稀释到7-1000pg.mL-1范围，采用人干扰素γELISA试剂盒测定。2结果2.1RT-PCR扩增的huIFNγcDNA片段1.2%琼脂糖凝胶电泳显示在480bp处有一特异扩增条带,片段大小与理论预期值一致，见图1（略）。2.2DNA序列测定结果所获huIFNγ的cDNA序列为：5’-CAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATATTTTAATGCAGGTCATTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAA3CTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGGGAAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCGAGGTCGAAGAGCATCCCAGTAA-3’BLAST比对显示与GenBank中编码人干扰素γcDNA序列一致。2.3pQE80L-huIFNγ经BamHI和HindIII双酶切后琼脂糖凝胶电泳显示在480bp和4.7Kb各有一条带，证明pQE80L/huIFNγ重组质粒已经被成功构建。2.4蛋白的诱导表达pQE80L/huIFNγ质粒的DH5α菌经IPTG诱导后表达了目的蛋白，并以包涵体形式存在。2.5蛋白的鉴定Westernblot分析显示,经诱导的菌体裂解物与抗His单抗反应,在分子量约17KD处出现单一条带,而未经诱导的菌体则无此反应,说明融合有6His目的蛋白得到表达，见图2（略）。2.6蛋白的纯化及检测蛋白经表达、提取和Ni2+-NTA纯化后行SDS-PAGE,结果电泳谱中呈单一条带,说明目的蛋白具有较高纯度，见图3（略）；双抗夹心ELISA法检测出huIFNγ。3讨论干扰素γ又称免疫干扰素,巨噬细胞激活因子等,具有抗肿瘤、抗病毒和调节细胞分化等作用[3，4]。干扰素γ主要由T细胞和NK细胞在抗原或细胞有丝分裂素如ConA等的刺激下诱生，具有很强的抗肿瘤和抗病毒等活性。在一步反向PCR法扩增编码huIFNγcDNA时，为了获得高丰度的huIFNγmRNA,我们选取接受卡介菌多糖核酸注射液的志愿者受试者静脉血，采用淋巴细胞分离液分离单个核细胞，单个核细胞中主要含T细胞、NK细胞和B细胞等，这样就提高了一步反向PCR模板丰度，使一步反向PCR易于得到阳性结果。参考文献：（略）