HPLC1.

高效液相色谱法(HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC)20.1.1高效液相色谱法的产生和发展高压、高速的现代高效液相色谱仪于1967年面世，导致高效液相色谱法(high-performanceliquidchromatography，HPLC)的产生。薄壳型填料，柱效仅每米1000~3000塔板数5~10μm球型和无定型微粒硅胶，每米5~6万理论塔板数高度均匀甚至单分散1~3μm硅胶基质球形填料，达15~30万理论塔板/m。新型分离模式和方法不断增加基本特点1.高效、高速、高灵敏度、高选择性2.填料粒径和流动相性质影响色谱柱效3．局限性操作条件1.流动相对分离选择性的影响2.柱外效应3.操作压力适用范围广20.1.2.高效液相色谱法的特点及与其他色谱法比较1.吸附色谱(adsorptionChromatography)2.分配色谱(partitionChromatography)3.离子交换色谱(ion-ExchangeChromatography)4.体积排阻色谱(sizeExclusionChromatography)需要指出的是每种色谱方法通常存在一种起支配作用的主要保留机理，但可能还存在次要的其他机理。20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系根据固定相和液体流动相相对极性的差别，有正相色谱和反相色谱两种色谱体系或方法。反相色谱和正相色谱主要区别是流动相和固定相的相对极性，最初形成于液液分配色谱，现已广泛应用于其他各种色谱方法。上述每种色谱类型均可进一步分为多个不同色谱方法。这些方法可用于分析分离，也可用于制备分离，各色谱方法在相关领域应用互相补充。20.1.3.高效液相色谱法分类和正反相色谱体系现代高效液相色谱使用3~10μm柱填料，为达到适用的流动相流速，高压泵需提供几十MPa或数百大气压力的柱前压。因而HPLC仪器比其他类型的色谱仪要复杂和昂贵。20.2.高效液相色谱仪HPLC示意图20.2.高效液相色谱仪现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器，一般为玻璃瓶。每个储瓶容积500~2000mL。储液瓶位置要高于泵体，以保持一定的输液静压差，在泵启动时易于让残留在溶剂和泵体中微量气体通过放空阀排出。储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置，这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检测器正常工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅拌下真空或超声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性气体带出溶解在溶剂中空气。储液器的溶剂导管入口处装有过滤器，以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣，防止损坏泵、进样阀或堵塞色谱柱。20.2.1.流动相贮器和溶剂处理系统通用HPLC仪输液泵系统的基本要求是：提供(50-500)×105Pa的柱前液压；输出无脉动恒定的液流；流速范围0.1-10mL/min；流速控制精度0.5%或更好；系统组件耐腐蚀(密封性良好的不锈钢或氟塑料)。高压泵产生的液体高压没有爆炸危险，因为液体的压缩性极小。最重要的是系统密封性能好。目前常使用的有三种类型的输液泵，即往复柱塞泵、气动放大泵、螺旋注射泵，它们各有优、缺点。往复柱塞泵20.2.2.高压泵系统1.电机，2.往复凸轮，3.密封柱塞，4.吸排液单向阀，5.溶剂入口，6.脉动阻尼器,7.接色谱柱。高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起柱前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。进样阀20.2.3.进样系统六口旋转进样阀示意图色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm以上。一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离的性能不受影响。20.2.4.高效液相色谱柱1.色谱柱类型按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半制备柱、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。20.2.4.高效液相色谱柱2.保护柱一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去溶剂中的颗粒杂质和污染物，而且可除去样品中含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱，延长使用寿命。3.柱恒温器对色谱柱严格控制温度可获得重现性更高保留值和更好分离色谱图。在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。20.2.5.液相色谱检测器l.光吸收检测器：紫外吸收检测器，光二极管阵列检测器，红外吸收检测器2.荧光检测器3.示差折光率检测器4.蒸发光散射检测器5.电化学检测器20.2.5.液相色谱检测器20.3.1.高效液相色谱固定相高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。20.3.高效液相色谱固定相和流动相由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是：1.化学惰性，不与固定相和被分离组分发生化学反应，保证柱的稳定性和分离的重现性。2.适用的物理性质，包括沸点较低，以便于分离组分和溶剂回收;低粘度，利于提高传质速率和分离速度、降低柱前压;弱或无紫外吸收等，以降低UV检测器本低响应，提高检测灵敏度;对样品具有适当溶解能力等。3.溶剂清洗和更换方便，毒性小、纯度高、价廉等，便于操作和安全。20.3.2.液相色谱流动相20.3.2.液相色谱流动相20.4.吸附色谱(AdsorptionChromatography)20.4.1.液固吸附色谱固定相吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。在高效液相色谱法中，表面多孔型和全多孔型都可作吸附色谱中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小。孔穴浅的优点，能极大地提高柱效。但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多孔型微粒填料。当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分子。于是，在固定相表面发生竞争吸附:20.4.2．吸附色谱分离机理Xs+nMmXm+nMs吸附解吸研究最多、应用最广泛的高效液相色谱类型。可分为液-液色谱和化学键合相色谱。前者是早期主要分配色谱类型，以物理吸附涂渍固定液在多孔载体表面上为固定相；后者以键合相为固定相，即化学键合固定相至载体或基质表面。化学键合相色谱巳成为占绝对优势的分配色谱类型。20.5.分配色谱(PartitionChromatography)液一液分配色谱法（LLPC）在液-液色谱中，流动相和固定相都是液体，能适用于各种样品类型的分离和分析（极性的和非极性的、水溶性和油溶性的、离子型的和非离子型的化合物）。（1）分离原理液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。不同的是液液色谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。（2）固定相由于液液色谱中流动相参与选择竞争，因此，对固定相选择较简单。只需使用几种极性不同的固定液即可解决分离问题。为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。代替了固定液的机械涂渍，它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。约有3/4以上的分离分析是在化学键合固定相上进行的。（3）流动相在液液色谱中为了避免固定液的流失。对流动相的一个基本要求是流动相与固定相尽可能不互溶，而且流动相与固定相的极性差别越显著越好。根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱，它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱。它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。此法是利用离子交换原理和液相色谱技术的结合来测定溶液中阳离子和阴离子的一种分离分析方法。凡在溶液中能够电离的物质，通常都可用离子交换色谱法进行分离。它不仅适用无机离子混合物的分离，亦可用于有机物的分离，例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。因此，应用范围较广。20.6.离子交换色谱离子交换色谱法是利用不同待测离子对固定相亲和力的差别来实现分离的。其固定相采用离子交换树脂，树脂上分布有固定的带电荷基团和可游离的平衡离子。当待分析物质电离后产生的离子可与树脂上可游离的平衡离子进行可逆交换，其交换反应通式如下：阳离子交换：阴离子交换：20.6.1.离子交换平衡Xm++YRs+_Y+mX+Rs+_X_mYR+s_+Y_m+X_R+s体积排阻或排除色谱(Size-ExclusionChromatography,SEC),亦称为凝胶色谱或凝胶过滤色谱,是分析高分子化合物的色谱技术。SEC填料为微粒均匀网状多孔凝胶材料。比填料平均孔径大的分子被排阻在孔外而无保留，被最先洗出;分子体积比孔径小的分子完全渗透进入孔穴，最后洗出;处于这两者之间具中等大小体积分子渗透进入孔穴，由于渗透能力差异而显示保留不同，产生分子分级，这取决于分子体积，在一定程度上亦与分子形状有关。因此，SEC分离是基于溶质分子体积差异在凝胶固定相孔穴内的排阻和渗透性大小。20.7.体积排阻色谱20.7.1.分离原理凝胶色谱法原理分离类型的选择1．据相对分子质量选择相对分子质量十分低的样品，其挥发性好，适用于气相色谱。标准液相色谱类型（液–固、液–液、及离子交换色谱）最适合的相对分子质量范围是200～2000。对于相对分子质量大于2000的样品，则用尺寸排阻法为最佳。2．根据溶解度选择清楚样品在水、异辛烷、苯、四氯化碳、异丙醇中的溶解度是很有用的。如果样品可溶于水属则属于能离解物质，以采用离子交换色谱为佳；如样品可溶于烃类（如苯或异辛烷），则可采用液–固吸附色谱；如样品溶解于四氯化碳，则多采用常规的分配和吸附色谱分离；如样品既溶于水又溶于异丙醇时，常用水和异丙醇的混合液作液–液分配色谱的流动相，以憎水性化合物作固定相。3．根据分子结构选择用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。然后，确定采用什么方法合适。例如，酸、碱化合物用离子交换色谱；脂肪族或芳香族用液–液分配色谱、液–固吸附色谱；异构体用液–固吸附色谱；同系物不同官能团及强氢键的用液–液分配色谱。液相色谱分离类型选择参考表