HPLC培训教材2

色谱流动相概念介绍流动相导论溶剂系统可以是一种或多种水溶液或有机溶剂携带样品流经色谱柱至检测器当与样品发生相互作用时，样品则发生分离选择溶剂需考虑的问题极性与溶剂强度纯度、过滤、除气与其他溶剂的互溶性缓冲溶液与pH等梯度或梯度洗脱分析流动相的要求①流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。②纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。③必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。④粘度要低（应2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。⑤对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。⑥样品易于回收。应选用挥发性溶剂。HPLC用水HPLC用水HPLC应用中要求超纯水，如检测器基线的校正和反相柱的洗脱。进行HPLC、GC、电泳和荧光分析，或在涉及组织培养时，没有有机物污染是非常重要的。美国药典24版（2000年）要求TOC＜0.5mg/L（用标准蔗糖溶液1.19mg/L），电导率在室温pH6时≤2.4µS/cm（即≥0.42MΩ·cm）。HPLC级水增加吸收特性：在1cm池中，用超纯水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分别不得过0.01、0.01和0.05。增加不挥发物，≤3ppm（中国药典纯水≤10ppm）。选择正确的流动相合适的流动相改善分离效果要求性质稳定，对色谱柱无影响与检测器匹配对样品有很好的溶解性低黏度、低沸点纯度高易得到，价格适中尽量避免使用有毒溶剂反相色谱使用的溶剂多用水作主要的流动相组成(A)水极性强、有低的蒸汽压除极性或离子型溶质外所有疏水性物质均会附着在固定相上造成保留必须使用色谱级纯水，避免系统污染污染调整有机溶剂（作修饰剂）(B)的浓度是改变组分保留的主要因素有三种反相色谱常用的有机溶剂Acetonitrile,Methanol,THF正相色谱法与反相色谱法比较表正相色谱法反相色谱法固定相极性高～中中～低流动相极性低～中中～高组分洗脱次序极性小先洗出极性大先洗出流动相的准备配置流动相混合、除气、过滤溶剂的混合每一组成的溶剂在混合前必须分开测量体积再混合两种溶剂混合后的体积通常不是分开体积的总和流动相的准备—除气气泡的形成空气在混合溶剂中的溶解度低于纯溶剂多余的气体将离开溶剂形成气泡流动相的准备—过滤将流动相中的颗粒除去细小颗粒会阻塞色谱柱影响泵的使用影响检测器流通池储液瓶加盖溶剂进口加过滤头加预柱保护色谱柱流动相的准备—添加剂缓冲溶剂维持溶液的pH至少添加50-100mM需避免加入缓冲集后发生沉淀抗氧化剂保护样品和仪器硬件pHrangeBufferUVcutoff（nm）2-3.5Phosphate2103.6-6Acetate2206-8phosphate210流动相的pH值反相离子抑制技术——反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品通过调节流动相的pH值，抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形。弱酸样品：流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液弱碱样品：通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。流动相的准备—pH值流动相的贮存流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。等度洗脱等度洗脱不能完全分离样品某些样品太复杂较早洗脱出的色谱峰分离度太差较晚洗脱出的色谱峰变宽或拖尾考虑梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱时流动相强度随溶剂组成的改变而增强梯度洗脱广泛适用于许多复杂样品与生物、聚合物样品的分离实验后以强溶剂清洗色谱柱对未知样品可经梯度找到适当的等度条件梯度洗脱梯度洗脱程序强、弱、急、缓不需等待这一段时间组分全部流出时既可停止色谱柱导论柱的构造色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。柱管多用不锈钢制成，压力不高于70kg/cm2时，管内壁要求有很高的光洁度。为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同。色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径0.2~20µm(5~10µm)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。色谱柱分类按分离模式色谱柱类型分离原理适用对象反相柱溶质疏水性不同，在流动相与固定相分配系数差异而分离大多数有机化合物，样品一般溶于水相体系正相柱溶质极性不同，在吸附剂上吸附性强弱差异而分离中至强极性化合物，样品一般溶于有机溶剂离子交换柱溶质所带电荷不同，与离子交换剂库仑作用力差异而分离离子型或可解离的化合物，样品一般溶于不同pH或不同离子强度水溶液中尺寸排阻色谱分子尺寸及形状不同，引起溶质在多孔填料中滞留时间差异而分离引起溶質在多孔填料中不同停留而分离可溶于有机溶剂或水溶剂中的所有非交联型化合物色谱柱分类按分离规模色谱柱类型尺寸（ID/mm）备注生产型色谱柱100一般用装柱机制备柱25-100半制备柱5-25毫克级至克级制备分析柱2-5典型为4.6mm细径管柱0.8-0.2金属柱或PEEK柱毛细管柱0.05-0.5填充柱或开管柱微径管柱纳米管柱0.1填充柱或開管柱色谱填料—硅胶硅胶—液相色谱法应用最广的极性固定相早期：无定型硅胶颗粒100um、传质速度慢、柱效低中期：薄壳型硅胶固定相玻璃珠涂敷硅胶颗粒层30-40um、孔径均一，渗透性好，溶质扩散性快高效、分离快速，但样品负载量低后期：全多孔微粒10um、粒度均匀、孔径均一样品负载量大装填短柱可实现高效、快速分离键和相全多孔或薄壳型硅胶机械强度好、表面反应活性高、表面积与孔径结构易控制硅胶表面具有活性强的硅烷醇基团加入硅烷化试剂与之反应仍有未反应的残余silonalgroup影响非极性键和相的疏水性吸附极性化合物或溶剂须以小分子硅烷化试剂进行封尾处理色谱柱的选择样品分子量2000溶于水分子量2000溶于THF分子量2000溶于水溶于有机溶剂极性非极性中等极性离子性非离子性CationicIonoSpherCAnionicIonoSpherCOmniSpherC18MicrosorbC18ChromSpherC18MicrosorbC8ChromSpherC8MicrosorbC4OmniSpherC18MicrosorbC18ChromSpherC18MicrosorbC8ChromSpherC8ChromSpherPAHPolaisAC18ChromSpherSiMicrosorbSiMicrosorbCNMicrosorbBDSMicrosorbNH2色谱柱选择类型性质分离方式应用范围烷基C18非极性反相、离子对中等极性化合物化合物，溶于水的高极性化合物烷基C8非极性反相、离子对与C18类似，但保留特性不如C18苯基C6H5弱极性反相、离子对非极性至中等极性化合物酚基C6H5OH弱极性反相中等极性化合物，保留特性与C8相似，但对多环芳烃、极性芳香族化合物、脂肪酸等??性不同氰基CN极性正相（反相）正相相似于硅胶吸附，为氢键接受体，适合分析极性化合物，溶质保留值比硅胶柱低，反相可提供不同于C8、C18、苯基柱的分离特性胺基NH2极性正相（反相、阴离子交换）正相可分离极性化合物如：脂类、含氯的农药；反相分离单糖、双糖色谱柱选择除固定相选择外，还要考虑内径、柱长、填料粒径色谱柱内径柱容量随柱内径增加而增加小内径色谱柱柱效高，省溶剂色谱柱形态ID(mm)Load(mg)流速(ml/min)半制备8-2010-505-30标准分析4.611窄径柱2.00.20.2微径柱1.00.050/05色谱柱选择填料粒径10um—对某些分离其分离度已足够5um—通常建议采用3um—柱效相当高，但产生背压也较高，只用于短柱填料粒径越小，色谱柱污染阻塞的可能性越大色谱柱的安装避免死体积、漏夜或损坏柱子使用正确的接头尽可能缩短连接管路长度、降低柱外效应管路切口必須平整在接上色谱柱前先将管路中的气泡赶净色谱柱安装的方向性接头不可拧太紧打开输液泵、检查柱是否漏相关术语死时间(deadtime，t0)——不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。在反相HPLC中可用苯磺酸钠来测定死时间。死体积(deadvolume，V0)——由进样器进样口到检测器流动池未被固定相所占据的空间。它包括4部分：进样器至色谱柱管路体积、柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）、柱出口管路体积、检测器流动池体积。其中只有Vm参与色谱平衡过程，其它3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。V0＝F×t0（F为流速）保留时间(retentiontime，tR)——从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。调整保留时间(adjustedretentiontime，t'R)——扣除死时间后的保留时间。也称折合保留时间(reducedretentiontime)。在实验条件（温度、固定相等）一定时，t'R只决定于组分的性质，因此，t'R（或tR）可用于定性。t'R＝tR－t0①避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。②应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。③一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。④选择使用适宜的流动相（尤其是pH），以避免固定相被破坏。有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶“饱和”，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。⑤避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。⑥经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50~75ml。⑦保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇，柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。⑧色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被