微生物学试验多媒体课件

多媒体课件目录实验一实验二实验三实验四实验五实验六实验七实验八实验九实验十实验十一实验十二环境中微生物的检查普通光学显微镜的使用细菌运动性的观察细菌的形态结构观察——简单染色、革兰氏染色细菌的荚膜染色和芽孢染色放线菌的形态结构观察霉菌的形态结构观察微生物细胞大小的测定显微镜下直接测数法--血球计数板法理化因素对微生物的影响培养基的制备土壤微生物的分离与测数一.实验目1.了解环境中微生物的存在。2.比较来自不同场所与不同条件下细菌的数量和类型。3.观察不同类型微生物的菌落形态特征。4.体会无菌操作的重要性，初步建立微生物工作者必须具有的“无菌”概念。二.实验原微生物种类繁多且无处不在t人体体表及体内存在大量的微生物：皮肤表面：平均10万个细菌/平方厘米；口腔：细菌种类超过500种；肠道：微生物总量达100万亿，粪便干重的1/3是细菌，每克粪便的细菌总数为：1000亿个；t细菌数亿/g土壤，土壤中的细菌总重量估计为：1.0034×1016吨；t每张纸币带细菌：900万个；t每个喷嚏的飞沫含4500-150000个细菌，重感冒患者为8500万。但微生物个体很小，肉眼不可见球菌杆菌螺旋菌0.5～1μm0.5～1μm×1～8μm0.3～1μm×1～50μm若用营养琼脂平板法进行检测，可以看到其群体结构。平板培养基含有细菌生长所需要的营养成分，当取自不同来源的样品接种于培养基上，在适宜温度下培养，1～2d内每一菌体即能通过很多次细胞分裂而进行繁殖，形成一个可见的细胞群体的集落，称为菌落。每一种细菌所形成的菌落都有它自己的特点，例如菌落的大小、表面干燥或湿润、隆起或扁平、粗糙或光滑，边缘整齐或不整齐，菌落透明、半透明或不透明，颜色以及质地疏松或紧密等。因此，可通过平板培养来检查环境中细菌的数量和类型。三.实验器1.培养基肉膏蛋白胨琼脂平板2.仪器或其他用具记号笔四.实验步1.编号任何一个实验，在动手操作前均需首先将器皿用记号笔做上记号，写上班级、姓名、日期，本次实验还要注明处理号，写在皿底的一边，不要写在当中，以免影响观察结果。培养皿的记号一般写在皿底上，如果写在皿盖上，同时观察两个以上培养皿的结果，打开皿盖时，容易混淆。2.环境中微生物的检查（1）空气将一个肉膏蛋白胨平板放在桌面上，移去皿盖，使其暴露在空气中5~10min后盖上皿盖。（2）手指移去皿盖，用手指在琼脂平板的表面轻轻地来回划线，盖上皿盖。（3）头发取头发一根，在平板表面任一方向划线3~5条，盖上皿盖。（4）咳嗽将揭开皿盖的琼脂平板放在离口约6～8cm处，对着琼脂表面用力咳嗽，然后盖上皿盖。3.将所有的琼脂平板翻转使皿底朝上，放28℃培养箱，培养2～3d。（1）菌落计数在划线的平板上，如果菌落很多而重叠，则数平板最后1/4面积内的菌落数。不是划线的平板，也一分为四，数1/4面积的菌落数。五.实验报（2）根据菌落大小、形态、高度、干湿等特征观察不同的菌落特征。但要注意，如果细菌数量太多，会使很多菌落生长在一起，或者限制了菌落生长而变得很小，因而外观不典型，故观察菌落的特点时，要选择分离的很开的单个菌落。将你自己的平板结果记录于下表中。特征描写皿号菌落数(近似值)形状大小色泽光泽高度透明度表面边缘1234CK菌落特征描写方法如下：①形状：圆状、丝状、不规则状、假根状。②大小：以直径表示。③表面：光滑、干燥、湿润、皱褶。④光泽：玻璃状、蜡质状、油脂状。⑤高度：扁平、隆起、凹下。⑥透明程度：透明、半通明、不透明。⑦边缘：整齐、不整齐。1.比较各种来源的样品，哪一种样品的平板菌落数与菌落类型最多？2.通过本次实验，在防止培养物的污染和防止细菌的扩散方面，你学到些什么？有什么体会？一.实验目1.学习并掌握油镜的原理和使用方法。2.学习普通台式显微镜的结构、各部分的功能和使用方法。二.实验原¾1676年，微生物学的先驱荷兰人列文虎克（Antonyvanleeuwenhoek）首次观察到了细菌。¾列文虎克利用业余时间制造过400多架单式显微镜和放大镜，放大率一般为50~200倍。现代普通光学显微镜利用目镜和物镜两组透镜系统来放大成像，故又称为复式显微镜。它们由机械装置和光学系统两大部分组成（图2-1）。1.镜座；2.载物台；3.镜臂；4.棱镜套；5.镜筒；6.接目镜；7.转换器；8.接物镜；9.聚光器；10.虹彩光圈；11.光圈固定器；12.聚光器升降螺旋；13.反光镜；14.细调节器；15.粗调节器；16.标本夹在显微镜的光学系统中，物镜的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜配置的几种物镜中，油镜的放大倍数最大，对微生物学研究最为重要。与其他物镜相比，油镜的使用比较特殊，需在载玻片和镜头之间加滴镜油，这主要又有如下两方面的原因：1.增加照明亮度油镜的放大倍数可达100×，放大倍数这样大的镜头，焦距很短，直径很小，但所需要的光照强度却最大。从承载标本的玻片透过来的光线，因介质密度不同（从玻片进入空气，再进入镜头），有些光线会因折射或全反射，不能进入镜头，致使在使用油镜时会因射入的光线较少，物像显现不清。所以为了不使通过的光线有所损失，在使用油镜时需在油镜和玻片之间加入与玻璃的折射率（n=1.55）相仿的镜油（通常使用香柏油，其折射率n=1.52）。2.增加显微镜的分辨率显微镜的分辨率或分辨力（resolutionorresolvingpower）是指显微镜能辨别两点之间的最小距离的能力。从物理学角度看，光学显微镜的分辨率受光的干涉现象及所用物镜性能的限制，可表示为：NAD2λ＝分辨率式中：λ=光波波长，NA=物镜的数值孔径值。光学显微镜的光源不可能超出可见光的波长范围（0.4～0.7μm），而数值孔径则取决于物镜的镜口角和玻片与镜头间介质的折射率，可表示为：NA=n·sinθ。式中θ为光线最大入射角的半数。它取决于物镜的直径和焦距，一般来说在实际应用中最大只能达到120°，而n为介质折射率。由于香柏油的折射率（1.52）比空气及水的折射率（分别为1.0和1.33）要高，因此以香柏油作为镜头与玻片之间介质的油镜所能达到的数值孔径（NA一般在1.2～1.4）要高于低倍镜、高倍镜等干镜（NA都低于1.0）。若以可见光的平均波长0.55μm来计算，数值孔径通常在0.65左右的高倍镜只能分辨距离不小于0.4μm的物体，而油镜的分辨率却可达到0.2μm左右。三.实验器1、菌种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和四联球菌染色玻片标本。2、溶液或试剂香柏油、1:3酒精乙醚混合液。3、仪器或其他用具显微镜、擦镜纸。四.实验步1.观察前的准备（1）显微镜的安置置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘约3～4㎝。镜检时姿势要端正。（2）光源调节安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镜采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或凸面反光镜并调节其角度，使视野内的光线均刀，亮度适宜。（3）根据使用者的个人情况，调节双筒显微镜的目镜，双筒显微镜的目镜间距可以适当调节，而左目镜上一般还配有曲光度调节环，可以适应眼距不同或两眼视力有差异的不同观察者。（4）聚光器数值孔径值的调节调节聚光器虹彩光圈值与物镜的数值孔径值相符或略低。有些显微镜的聚光器只标有最大数值孔径，而没有具体的光圈数刻度。使用这种显微镜时可在样品聚焦后取下一目镜，从镜筒中一边看视野，一边缩光圈，调节光圈的边缘与物镜边缘黑圈相切或略小于其边缘。因为各物镜的数值孔径值不同，所以每转换一次物镜都应该进行这种调节。在聚光器的数值孔径确定后，若需要改变光照强度，可通过升降聚光器或改变光源的亮度来实现，原则上不应再通过光圈的调节。当然，有关虹彩光圈、聚光器高度和照明光源强度的使用原则也不是固定不变的，只要能获得良好的观察效果，有时也可根据不同的具体情况灵活运用，不一定拘泥不变。2.显微观察在目镜保持不变的情况下，使用不同放大倍数的物镜所能达到的分辨率及放大率都是不同的。一般情况下，特别是初学者，进行显微观察时应遵从由低倍镜到高倍镜再到油镜的观察程序，因为低倍数物镜视野相对大，易发现目标及确定检查的位置。（1）低倍镜观察将染色标本玻片置于载物台上，用标本夹夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方。下降10×物镜，使其接近标本，用粗调节器慢慢升起镜筒，使标本在视野中初步聚焦，再使用细调节器调节图像清晰。通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适的目的物，仔细观察并记录观察到的结果。在任何时候使用粗调节器聚焦物象时，必须养成先从侧面注视小心调节物镜靠近标本，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开标本进行准焦的习惯，以免因一时的误操作而损坏镜头及玻片。（2）高倍镜观察在低倍镜下找到合适的观察目标并将其至视野中心后，轻轻转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置。对聚光器光圈及视野亮度进行适当调节后微调细调节器使物像清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录所观察到的结果。在一般情况下，当物像在一种物镜中已清晰聚焦后，转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置进行观察时，物象将保持基本聚焦的状态，这种现象称为物镜的同焦（parfocal）。利用这种同焦现象，可以保证在使用高倍镜或油镜等放大倍数高、工作距离短的物镜时仅用细调节器即可对物像清晰聚焦，从而避免由于使用粗调节器时可能的误操作而损坏镜头或载玻片。（3）油镜观察在高倍镜或低倍镜下找到要观察的样品区域后，用粗调节器将镜筒升高，然后将油镜转到工作位置。在待观察的样品区域加滴香柏油，从侧面注视，用粗调节器将镜筒小心地降下，使油镜浸在油镜中并几乎与标本相接。将聚光器升至最高位置并开足光圈，若所用聚光器的数值孔径超过1.0，还应在聚光镜与载玻片之间加滴香柏油，保证其达到最大的效能。调节照明使视野的亮度合适，用粗调节器将镜筒徐徐上升，直至视野中出现物像并用细调节器使其清晰准焦为止。有时按上述操作还找不到目的物，则可能由于油镜头下降还没有到位，或因油镜上升太快，以至眼睛捕捉不到一闪而过的物像。遇此情况，应重新操作。另外应特别注意不要因在下降镜头时用力过猛，或聚焦时误将粗调节器向反方向转动而损坏镜头及载玻片。3.显微镜用毕后的处理（1）上升镜筒，取下载玻片。（2）用擦镜纸拭去镜头上的镜油，然后用擦镜纸蘸少许酒精乙醚混合液擦去镜头上残留的油迹，最后再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。切忌用手或其他纸擦拭镜头，以免使镜头沾上污渍或产生划痕，影响观察。（3）用擦镜纸清洁其他物镜及目镜，用稠布清洁显微镜的金属部件。（4）将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八”字形，再向下旋。同时把聚光镜降下，以免接物镜与聚光镜发生碰撞危险。分别绘出你在低倍镜、高倍镜和油镜下观察到的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌及四连球菌的形态，包括在三种情况下视野中的变化，同时注明物镜放大倍数和总放大率。五.实验报（1）用油镜观察时应注意哪些问题？在载玻片和镜头之间加滴什么油？起什么作用？（2）试列表比较低倍镜、高倍镜及油镜各方面的差异。为什么在使用高倍镜及油镜时应特别注意避免粗调节器的误操作？（3）影响显微镜分辨率的因素有哪些？（4）根据你的实验体会，谈谈应如何根据所观察微生物大小，选择不同的物镜进行有效的观察。一.实验目1.学习水浸片的制作方法。2.观察细菌的运动性。二.实验原鞭毛(flagellum,复flagella)是在运动细菌细胞表面着生的一根或数根从细胞内伸出的长丝状、螺旋形的附属物，为细菌的“运动器官”。观察和判断细菌鞭毛的方法：¾电子显微镜直接观察¾光学显微镜下观察：鞭毛染色和暗视野显微镜¾根据培养特征判断：半固体穿刺、菌落（菌苔）形态具鞭毛的细菌在液体中借助鞭毛的旋转，使菌体能定向的泳动。幼龄菌运动活泼，老龄菌运动性差或失去鞭毛不能运动。观察细菌的运动性可采用水浸片法。在显微镜下观察时，应减弱光照强度，并注意区分是细菌的真运动，还是因液体流动引起细菌随水流而动，或呈现无规则、原位颤动的布朗运动三.实验器1.菌种培养24~36h的枯草芽孢杆菌菌悬液