微生物工程 第2章 发酵菌种选育

第二章微生物工业的菌种第一节菌种的分离简介一、菌种的来源•根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买•从大自然中分离筛选新的微生物菌种二、分离思路•新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。•实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。•有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。•定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。•采样：有针对性地采集样品。•增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。•分离：利用分离技术得到纯种。•发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新菌种分离与筛选的步骤（一）、含微生物材料的选择土壤海洋生物体内极端环境和特殊的生态环境一般田园土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主;富含碳水化合物的土壤和沼泽地中，酵母和霉菌较多;植物体中富含菌物;海水中富含酵母菌;极端环境和特殊的生态环境:细菌,放线菌和酵母菌从自然界筛选•1、采样季节：对细菌和放线菌以温度适中，雨量不多的秋初为好;对菌物在植物生长季节均适合。•2、采样方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。•3、为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。大型菌类尽可能在野外分离（二）、材料的预处理热处理法膜过滤法化学药品处理用0.01N的NaOH处理样品，可分离得到小单孢菌。用4ml/L的氨水处理后，再用2mg/L的氯处理样品，分离得到了游动放线菌。（三）选择性培养•为了容易分离到所需目的菌种，让无关的微生物至少是在数量上不要增加，可以通过配制选择性培养基，选择一定的培养条件来控制。•例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。（四）、分离、筛选方案的设计筛选模型加选择压力诱饵法、富集培养反应特性随机分离筛选模型例如:在抗生素的筛选过程中，为避免致病菌的感染与扩散，一般不采用致病菌为试验的指示菌，尽可能选择非致病菌而又能代表致病菌的其它微生物作为试验的指示菌，这些试验指示菌就称为筛选模型。诱饵法：在分离样品或培养基中加入一些特殊的营养物，待菌生长一定时间后，再进行分离。如将涂石蜡的棒置于培养基中，可分离到诺卡氏菌。富集培养：指能增加混合菌群中所需菌株的一种技术，方法是在混合菌群中提供有利于所需菌株生长或不利于其它微生物生长的条件。反应特性：如分离蛋白酶，在不溶性蛋白的平板上可产生一清晰的透明圈，透明圈的大小可作为选择的依据。随机分离：制备一系列培养基，其中各种类型的养分成为限制因子。避免使用容易同化的碳、氮源，因为它们可能产生分解代谢物阻遏。（五）培养分离•尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法等等。菌种的培养温度放线菌：25～30℃嗜热菌：45～55℃嗜冷菌：4～10℃时间：延长培养时间可以分离到新的或不寻常的菌株（六）筛选•这一步是采用与生产相近的培养基和培养条件，通过三角瓶的容量进行小型发酵试验，以求得适合于工业生产用菌种。菌种筛选时应考虑的一些重要指标：1、菌的营养特性2、菌的生长温度3、菌对生产设备和生产过程的适应性4、菌种的稳定性5、容易从发酵液中提取产物6、产物的得率高（七）毒性试验•自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有关的菌种，更应慎重。•据有的国家规定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食用，均需通过两年以上的毒性试验。第二节、高产菌株的选育（一）、自然选育（二）、常规诱变育种（三）、合理诱变育种（四）、原生质体融合技术（五）、基因工程技术从自然界直接分离得到的菌种，不能立即适合实际生产的需要，只有通过选育，才能提高产物的产量，改进品质，甚至简化工艺。（一）、自然选育不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。评价（二）、常规诱变育种利用物理、化学等诱变剂，使微生物发生突变而进行菌种选育的过程。评价诱变物理、化学或生物诱变方法常规诱变育种的一般操作过程出发菌种原种特性考察斜面或摇瓶培养孢子液细胞液诱变剂处理稀释平板分离以未处理的菌种液为对照，计算致死率；观察单菌落形态，统计形态变异率。选择、调取单菌落，转管保存初筛（以出发菌种为对照）选出高产突变株，并留种保存复筛（以出发菌种为对照）根据情况进行第二、第三…复筛选出高产突变株，并留种保存选出高产突变株，并留种保存高产菌株的稳定性实验菌种特性考察小发酵罐试验放大实验、中试考查高产菌种培养条件的优化实验大罐试验生产诱变育种应注意的几个问题（1）、出发菌株的选择（2）、复合诱变剂的使用（3）、诱变剂的剂量（4）、突变株的筛选（5）、高产突变株培养条件的优化常用物理、化学诱变剂：（1）、紫外线（2）、快中子（3）、高频电子流（4）、CO-60（5）、亚硝酸（6）、氮芥（7）、亚硝基胍（三）、合理诱变育种根据微生物的代谢调节机理来选择一定类型的微生物突变株，以获得高产菌株。代谢过程是由酶催化完成的，因此代谢途径的调节也就是酶的调节。酶的调节分为：酶合成的调节酶活性的调节酶合成的调节：诱导：只有在有诱导物存在的时候，酶才能合成，这样的酶称为诱导酶。不需诱导物就能合成的酶是组成酶。诱导又分为协同诱导、顺序诱导等。阻遏:是阻止酶的合成，又有反馈阻遏、分解代谢物阻遏等。酶活性的调节：对已经存在酶的活性进行调节，分为激活和抑制。酶的激活有前体激活、补偿性激活等，酶的抑制有终点产物反馈抑制、协同反馈抑制、累积反馈抑制等。（1）、选育组成型菌株（2）、选育抗反馈调节的突变株（3）、选育营养缺陷型（4）、选育负变菌株的回复突变株?（5）、选育条件抗性突变株（6）、选育细胞膜透性改变的突变株（7）、选育抗生素抗性突变株（四）、原生质体融合技术也称细胞融合技术，指将一个细胞与另一个细胞融合为一体，使一个细胞的遗传物质（包括核DNA和核外基因）进入另一个细胞。它的目的是：进入一个细胞的另一个细胞的遗传物质为这个细胞所接受，引起这个细胞遗传特性的改变，并且这种遗传特性的变异能够稳定遗传下去。原生质体融合简要说明：金色链霉菌，四环素发酵单位14000-17000g/ml淡红链霉菌（正定变种1482），柔红霉素发酵单位60-80g/ml原生质体原生质体原生质体融合再生、筛选得到PF-25菌株，柔红霉素发酵单位250-300g/ml阿克拉霉素产生菌（链霉菌）诱变突变株A不合成阿克拉霉素，但合成阿克拉霉素前体的类似物和2－hydroxyaklacinoe突变株B不合成阿克拉霉素，也不合成阿克拉霉素前体的类似物，但能在2－hydroxyaklacinoe上接上糖苷原生质体融合融合子产生2－羟基阿克拉霉素用原生质体技术提高发酵单位的例子产物性质菌种增产效果西索米星硫链丝菌肽碳青霉烯麦迪霉素庆大霉素头霉素C巴龙霉素种内种内种内种内种间属间种内种内种间Micromonosporaingoensis运青链霉菌灰色链霉菌生米卡链霉菌生米卡链霉菌/灰色链霉菌小单孢菌/灰色链霉菌小单孢菌Nocardialactamdurans链霉菌/弗氏链霉菌10－15％2倍10倍40％5倍58％52％15％5－6倍原生质体融合技术的优点：（1）、去除细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换和实现重组，不需要有已知的遗传操作系统（2）、原生质体融合后，两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生各种各样的基因组合而得到多种类型的重组子（3）、重组频率特别高（4）、可以和其它育种方法相结合（5）、可以用药物、温度、紫外线钝化亲株的一方，然后再进行融合，这样可以提高筛选的效率（6）、原生质体融合并不局限于种内，还可以进行种间和属间的原生质体融合（五）、基因工程技术无论用什么方式获得的DNA分子，插入到任何载体（包括病毒、细菌的质粒或者酵母），使之形成遗传物质的新组合（即重组DNA分子），再将它们转移到一种原来并不含有这样新组合的宿主细胞中去，使宿主细胞获得新的遗传信息并稳定遗传下去，成为新型生物。一个完整的基因克隆过程包括以下步骤•１、获得待克隆的DNA片段（基因）；•２、目的基因与载体在体外连接；•３、重组DNA分子导入宿主细胞；•４、筛选、鉴定阳性重组子；•５、重组子的扩增与／或表达。基因重组1、基因工程生产蛋白质及多肽类药物蛋白质及多肽药物的基因工程是生物工程中最活跃和最有成就的领域。目前应用基因工程方法生产的这类药物已投放市场的有胰岛素、干扰素、人生长激素、白介素2、促红细胞生长素、肿瘤坏死因子、人心钠素、表皮生长因子等。人胰岛素由A、B二条链组成，A是21个氨基酸，B链是30个氨基酸，由2个2S键相连。3、基因工程在抗生素生产菌种改造方面的应用①解除限速步骤，提高抗生素产量在抗生素合成中，某些步骤对整个生物合成至关重要，对这些关键步骤酶（限速酶）的改造，可以提高抗生素的产量，如十一烷基灵红菌素和秦乐菌素生物合成的最后阶段的酶是限速酶，该过程是由一个甲基转移酶控制的，将该酶基因克隆后，经过适当改造，再转入原菌株阻断突变株中，使得该酶活性大幅度提高，最终使抗生素的合成能力提高了近10倍。②阻断支路代谢，增加有效组份含量阿维菌素B组分向A组分的转化是由aveD基因编码的C5-O-甲基化酶催化的。OHOOOOOH3CCH3HOHCH3HHOHCH3RHCH31325222325OHOOOOOH3CCH3HOMeCH3HHOHCH3RHCH31325222325AveD③引入抗性基因或调节基因，提高抗生素产量大多数抗生素产生菌都具有对自身产生的抗生素的耐受能力，而抗生素的产量一定程度上取决于对自身产生的抗生素的耐受能力的大小，利用多烤贝质粒，克隆这些抗性基因，再转入到产生菌中，从而提高抗生素产生能力。如克隆氨基糖苷δ’-乙酰转移酶基因，再转入卡那霉素和新霉素产生菌中，结果使菌种自身对氨基糖苷类抗生素的抗性增加，使卡那霉素和新霉素的产量提高了2～6倍。④引入血红蛋白基因，提高抗生素产量在抗生素发酵过程中，供氧往往是一个限制因素，且大量消耗能源。在解决供氧方面也有不少成功的报道，美国科学家将与氧传递有关的透明颤菌的血红蛋白基因，克隆到天蓝色链霉菌中，可使在通气不足时放线紫红素的产量提高4倍。将血红蛋白基因克隆倒头孢菌素C产生菌后，该菌在发酵过程中氧耗明显下降，且有效增加了头孢菌素C的产量。三、菌种退化（一）、退化的原因（二）、防止退化的措施菌种退化：菌种的一个或多个特性，随时间的推移逐步减退或消失的现象，一般常指菌株的生活力、产孢能力衰退和目的产物产量的下降。（一）、退化的原因1、菌系不纯2、异核现象3、自然分化现象4、回复突变5、培养条件或保藏方法不利6、其它（一）、防止退化的措施1、多做平行菌种，少转接传代2、认真进行单菌落分离3、选择有利于高产菌，不利于低产菌的培养条件4、良好的保藏方法四、菌种保藏（一）、菌种保藏的原理（二）、常用菌种保藏的方法（三）、国内外重要的菌种保藏机构（一）、菌种保藏的原理1、控制培养基营养成份在最低水平2、缺氧3、干燥4、低温（二）、常用菌种保藏方法1、斜面冰箱保藏法2、砂土管保藏法3、覆盖惰性液体保藏法4、真空冷冻干燥保藏法5、－30℃低温保藏法6、液氮超低温保藏法（三）、国内外重要菌种保藏机构1、ATCC：美国模式培养物（菌）保藏中