微生物工程(一)

微生物工程（一）本章主要内容一．微生物工程的概念二．常见的工业微生物三．微生物育种技术四．微生物的营养和生长五．发酵工业的生产流程六．生物反应器和反应动力学七．微生物发酵产品八．资源和能源领域中的微生物工程（一）微生物工程概念微生物工程：就是研究利用微生物的新陈代谢作用生产一定的产品或达到其他社会目的的工程科学。一般的，微生物工程又可称为发酵工程，但严格来说，发酵（微生物培养）只是微生物工程的一部分，而不是全部，但是其核心内容。通常，微生物工程分为两大部分：发酵部分：主要是通过一系列的环节，提供条件，使菌体生长繁殖，并产生发酵所要的目的产物（代谢产物）。提纯部分：这部分是通过一些物理的、化学的手段、方法，将代谢产物从发酵醪中提纯出来，获得最终产品。按照对细胞生长是否需要氧气，发酵过程可分为好氧发酵：以氧作为电子受体。如动植物细胞培养，微生物发酵生产抗生素、有机酸、氨基酸等厌氧发酵：一般以有机物作为电子受体。如酒精发酵和乳酸发酵、丙酮和丁醇等及其沼气发酵等。发酵产品的生产特点：①一般操作条件比较温和；②以淀粉、糖蜜等为主，辅以少量有机、无机氮源为原料；③过程反应以生命体的自动调节方式进行；④能合成复杂的化合物如酶、光学活性体等；⑤能进行一些特殊反应，如官能团导入；⑥生产产品的生物体本身也是产物，含有多种物质；⑦生产过程中，需要防止杂菌污染；⑧菌种性能被改变，从而获得新的反应性能或提高生产率。2.微生物工业的范围⑴酿酒工业（啤酒、葡萄酒、白酒等）⑵食品工业（酱、醋等）⑶有机溶剂发酵工业（酒精等）⑷抗生素工业（青霉素、链霉素、土霉素等）⑸有机酸发酵工业（柠檬酸、醋酸、乳酸等）⑹酶制剂工（淀粉酶、蛋白酶等）⑺氨基酸发酵工业（谷氨酸、赖氨酸等）⑻核苷酸类物质发酵工业（肌苷酸等）⑼维生素发酵工业（维生素B族等）⑽生理活性物质发酵工业（激素、赤霉素等）⑾微生物菌体蛋白发酵工业（酵母、SCP等）⑿微生物环境净化工业（利用微生物处理废水、污水等）⒀生物能工业（沼气、纤维等发酵生产酒精、乙烯等物质）⒁微生物冶金工业（利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等）二常见的工业微生物（一）微生物的基础知识（二）细菌（三）放线菌（四）酵母（五）霉菌（一）微生物的基础知识1.什么是微生物：微生物（microorganism,microbe）是一类个体微小、结构简单，肉眼不可见或看不清楚的微小生物的统称。2.主要微生物类群：这个微小生物类群十分庞杂，它包括小到没有细胞结构的病毒（virus），单细胞原核的细菌（bacteria）、放线菌（actinomyces）、支原体（mycoplasma）、立克次氏体（rickettsia）、衣原体（chlamydia）等和属于真菌的酵母菌（yeast），霉菌（molde）等和原生动物（protozoa）等。3微生物的生物学特点与作用（1）种类繁多、分布广泛（2）生长繁殖快，代谢能力强（3）遗传稳定性差，容易发生变异（1）种类繁多、分布广泛微生物的多样性已在全球范围内对人类产生巨大影响。土壤中微生物的种类繁多，几乎所有的微生物都能从土壤中分离筛选得到，要分离筛选某中微生物，多数情况都是从土壤采取样品。首先微生物为人类创造了巨大的物质财富，目前所使用的抗生素药物，绝大多数是微生物发酵产生的，以微生物为劳动者的发酵工业，为工、农、医等领域提供各种产品。另外微生物也为人类带来巨大危害，如疫病的传播，并且引起疫病传播的新微生物种类总不断出现。（2）生长繁殖快，代谢能力强大肠杆菌（Escherichiacoli）在适宜的条件下，每20分钟即繁殖一代，24小时即可繁殖72代，由一个菌细胞可繁殖到47×1022个，如果将这些新生菌体排列起来，可绕地球一周有余；生理基础:因为微生物的代谢能力很强,由于微生物个体微小，单位体积的表面积相对很大，有利于细胞内外的物质交换，细胞内的代谢反应较快。极大的物质资源:正因为微生物具有生长快、代谢能力强的特点，才使得微生物能够成为发酵工业的产业大军，在工、农、医等战线上发挥巨大作用；在物质转化中的作用:如果没有微生物，自古以来的动、植物尸体不能分解腐烂，早已是动、植物尸体堆积如山，布满全球。（3）遗传稳定性差，容易发生变异微生物个体微小，对外界环境很敏感，抗逆性较差，很容易受到各种不良外界环境的影响；另外，微生物的结构简单，缺乏免疫监控系统,很容易变异。微生物的遗传不稳定性，是相对高等生物而言的，实际上在自然条件下，微生物的自发突变频率为10-6左右。微生物的遗传稳定性差，给微生物菌种保藏工作带来一定不便。另一方面，正因为微生物的遗传稳定性差，其遗传的保守性低，使得微生物菌种培育相对容易得多。通过育种工作，可大幅度地提高菌种的生产性能，其产量性状提高幅度是高等动、植物所难以实现的。（二）细菌1细菌的基本形态①球形球菌：直径0.5×2um②杆形宽×长0.5～1×1～5um大肠杆菌：0.5×2um③螺旋形宽×长0.5～1×1～50um④其它形状：丝状、三角形、方形等⑤异常形态畸形：由于化学或物理因素刺激，阻碍了细胞的发育，从而引起了异常的形态。衰颓形：由于培养时间过长，营养缺乏，代谢排泄物浓度积累过高等使细胞衰老而引起的异常形态2细菌的基本结构一般结构细胞壁细胞膜核区细胞质特殊结构荚膜芽孢鞭毛3革兰氏染色（1）细菌细胞壁细胞壁：位于细胞最外层的一层厚实、坚韧的外被，主要成分是肽聚糖，具有固定细胞外形和保护细胞不受损伤等生理功能。细胞壁的生理功能①提高机械强度、固定细胞外形、保护细胞不受损伤②为细胞生长、分裂和鞭毛运动所必需③一定的屏障作用（阻碍有害大分子的进入）④与细菌抗原性、致病性及对噬菌体的敏感性有关（2）细胞壁的分类革兰氏阳性菌(G+)①肽聚糖②磷壁酸革兰氏阴性菌(G-)①脂多糖②磷脂③脂蛋白④肽聚糖（3）革兰氏染色由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立结果:阳性菌G+—紫色阴性菌G-—红色结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染细菌固定GramstainofG+Staphylococcuscells.GramstainofG-E.colicells（三）放线菌1放线菌的形态构造细胞呈分枝丝状，介于细菌和真核生物之间；与细菌相似细胞壁主要为肽聚糖革兰氏染色阳性原核单细胞、多核菌丝直径与细菌相仿2菌丝基内菌丝（一级菌丝、营养菌丝）气生菌丝（二级菌丝）孢子丝（繁殖菌丝）（四）酵母酵母菌：泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌1特点①单细胞状态②出芽繁殖③发酵糖类产能④细胞壁含甘露聚糖⑤含糖量高、酸度较大的水生环境2酵母的形态酵母细胞的形态与构造细胞大小：细菌的10倍细胞形态：球状、卵圆状、柱状、香肠状3酵母菌细胞结构4繁殖方式芽殖（各属酵母都存在）裂殖（裂殖酵母属）节孢子（地霉属）掷孢子（掷孢酵母属）后垣孢子（白假假丝酵母）产无性孢子无性有性（产子囊孢子）酵母菌的繁殖方式5酵母菌与生产和生活的关系酵母菌与人类的关系①酒类的生产②面包的制作③乙醇甘油发酵④石油及油品脱蜡⑤饲用药用⑥单细胞蛋白生产SCP⑦活性物质提取⑧微生物学研究⑨真核表达系统⑩人类疾病（五）霉菌1霉菌：菌丝体发达而又不产生大型肉质子实体的丝状真菌分布只要有有机物就有霉菌的踪迹有机分解者：纤维素和木质素2霉菌的细胞形态与构造霉菌营养体的基本单位是菌丝，其直径通常为3－10mm，与酵母菌相似菌丝的分类（菌丝中是否有隔膜）无隔菌丝：毛霉、根霉有隔菌丝：曲霉、青霉卵孢子接合孢子子囊孢子担孢子有性孢子孢囊孢子分生孢子节孢子后垣孢子无性孢子孢子菌丝片段繁殖方式4繁殖5霉菌与生产和生活的关系工业产品：有机酸、酶制剂、抗生素、维生素、生物碱、生物活性物质、药物食品的生产制造：酱油、干酪工农业产品的霉变植物病原菌疾病：真菌毒素、黄曲霉毒素三微生物育种技术（一）为什么要发展微生物育种技术微生物育种：是以提高微生物菌株生产性能为目标，人为改造微生物菌株的遗传性能的过程（二）主要的维生素育种技术介绍1诱变育种技术2代谢工程育种技术3DNA重排育种1诱变育种技术（1）基本原理利用一些物理和化学的因素处理微生物细胞，使其遗传性状发生随机的突变，得到大量性状各异的突变株，然后再从众多突变菌株中以一定的方法筛选出生产性能改善的个体。（2）诱变剂：用于处理微生物以使其发生突变的物理或化学因素。可分为物理诱变剂和化学诱变剂两种以选育高产突变株为例(3)诱变育种的步骤原始菌种纯化斜面/肉汤培养单孢子/单细胞悬液诱变剂处理平板分离移至斜面小试中试初筛复筛计算存活率观察形态变异，挑单菌落良种保藏原菌种特性鉴定（4）分离和筛选(5)举例L-赖氨酸合成步骤三羧酸循环、天冬氨酸的生物合成、细菌和植物合成L-赖氨酸、苏氨酸的生物合成天冬氨酸激酶2，3-二氢二羧酸合成酶从上图可以看出，影响L-赖氨酸产量的因素表现在3个方面：一、L-赖氨酸和L-苏氨酸都会抑制天冬氨酸激酶二、L-亮氨酸会抑制2，3-二氢二羧酸合成酶三、赖氨酸合成需要消耗大量的丙酮酸，而丙酮酸也是丙氨酸、亮氨酸等多种氨基酸的共同前体，因此丙氨酸等生成可减少赖氨酸的合成。B育种过程：第一步是在含有SAEC（硫代赖氨酸，为赖氨酸的结构类似物）的培养基上筛选出SAEC抗性的突变株，使菌株的天冬氨酸激酶对L-赖氨酸和L-苏氨酸不敏感。为了进一步的提高产量，接下来还有多种选择其一、在SAEC抗性调节突变菌株基础上进一步筛选L-亮氨酸缺陷型突变株，解除L-亮氨酸的2，3-二氢二羧酸合成酶的抑制。其二、在SAEC抗性突变菌株基础上再进一步筛选出L-丙氨酸营养缺陷型菌株。其三，在SAEC抗性突变菌株基础上，选育对SAEC、γ-甲基-L-丙氨酸（L-丙氨酸类似物）和α-氯代己内酰氨（L-亮氨酸的结构类似物）具有多重抗性的L-丙氨酸营养缺陷型菌株，则L-赖氨酸产量会提高更多注：SAEC是硫代赖氨酸，为赖氨酸的结构类似物，SAECr表示是SAEC抗性Leu表示亮氨酸Leu-表示此此菌株是亮氨酸缺陷型菌株Ala表示丙氨酸，Ala-表示此此菌株是丙氨酸缺陷型菌株MA是γ-甲基-L-丙氨酸，系L-丙氨酸类似物CCL是α-氯代己内酰氨，系L-亮氨酸的结构类似物通过上述步骤，赖氨酸的产量变化如下：2代谢工程育种技术代谢工程：又称代谢途径或途径工程，是基于代谢流分析和基因重组技术改善菌种遗传性状的一种先进技术的工程技术。优点：方向性强、目标明确、效率高、技术手段先进、过程可控性和重现性好等缺点：需要掌握相应的微生物的代谢和遗传机理知识，以及基因操作工具。举例：S-腺苷-L-蛋氨酸（SAM）SAM：是甲硫氨酸(Met)的活性形式。在动植物体内广泛存在，它是由底物L-甲硫氨酸和ATP经S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶促合成的。细胞内存在两种S-腺苷甲硫氨酸合成酶酶SAM1：其基因的转录在高浓度蛋氨酸存在下受到抑制SAM2：转录不受蛋氨酸的抑制据此，可大大提高SAM2在DNA的拷贝，或者1.丙酮酸脱氢酶复合体2.柠檬酸合成酶3.顺乌头酸酶4.顺乌头酸酶5.异柠檬酸脱氢酶6.-酮戊二酸脱氢酶7.琥珀酰COA8.琥珀酸脱氢酶9.延胡索酸酶10.苹果酸脱氢酶按照起始物可将氨基酸的合成分成几个家族：㈠谷氨酸族（α-酮戊二酸族）包括：谷氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、赖氨酸和脯氨酸；㈡丙酮酸族包括：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸；㈢天冬氨酸族（早酰乙酸族）包括：天冬氨酸、天冬酰胺、苏氨酸和异亮氨酸；㈣磷酸甘油酸族包括：甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸；㈤芳香族包括：苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；另外，组氨酸的合成为单独的一条途径。