微生物检验13

1革兰阳性需氧杆菌2需氧芽胞杆菌属（Bacillus）48个种与医学有关5个种炭疽芽胞杆菌（B.anthracis）蜡样芽胞杆菌（B.cereus）蕈状芽胞杆菌（B.mycoides）巨大芽胞杆菌（B.megaterium）苏云金芽胞杆菌（B.thuringiensis）3第一节炭疽芽胞杆菌（Bacillusanthracis，B.anthraci)一、临床意义炭疽是人畜共患的急性传染病主要是牛、羊等食草类动物的传染病，人可通过接触或摄食病畜及畜产品而感染皮肤炭疽、肠炭疽、肺炭疽等，并发败血症，甚至炭疽性脑膜炎4致病物质荚膜：抗吞噬，有利于细菌在组织内繁殖扩散炭疽毒素：保护性抗原、致死因子、水肿因子5所致疾病炭疽病：传染源：患病食草动物及其制品或被污染物传播途径：接触——皮肤炭疽食用——肠炭疽吸入——肺炭疽可并发败血症，死亡率极高6•乙类传染病•发生肺炭疽按甲类处理病后可获得持久免疫力7形态染色:致病菌中最大的G+杆菌，两端平切、竹节状有毒株可有明显荚膜二、微生物特性炭疽芽胞杆菌亚甲基蓝染色×1000革兰染色×10008芽胞——椭圆形，小于菌体，位于菌体中央多在有氧条件下形成，25～30℃，在培养基中、土壤内、动物尸体解剖后暴露在空气中，都易形成芽胞在活体或完整未解剖尸体内不形成芽胞，尸体严禁解剖9培养特性：•需氧或兼性厌氧，生长条件不严格，最适温度30～35℃•普通培养基—扁平、粗糙、不透明、灰白色、无光泽，边缘不整齐的菌落，低倍镜下菌落边缘呈卷发状10BAP：12～15h不溶血，18～24h轻微溶血其他需氧芽胞杆菌大多溶血明显而快速炭疽杆菌在血琼脂平板中菌落11肉汤—絮状沉淀生长明胶—37℃18～24h表面液化成漏斗状，由于细菌沿穿刺线向四周扩散形成倒松树状。NaHCO3BAP：--有毒株—5%CO2、37℃24～48h、产生荚膜呈黏液型菌落，挑取时呈粘丝状(鉴别要点)--无毒株—粗糙型菌落12生化反应：分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、蕈糖，有些菌能迟缓发酵甘油和水杨素产酸不产气水解淀粉、还原硝酸盐不产生吲哚和硫化氢、不利用柠檬酸盐、不分解尿素在牛乳中生长2～4天牛乳凝固→缓慢胨化触酶（+）、卵磷脂酶弱（+）13抗原构造：菌体多糖抗原：--与毒力无关，耐热、耐腐败，长时间煮沸仍能与特异性抗体发生环状沉淀反应（Ascoli热沉淀反应）。--特异性不高，能与其他需氧芽胞杆菌、14型肺炎链球菌、人A血型抗原发生交叉反应。14•荚膜多肽抗原：--与毒力有关，有抗吞噬作用，有利于细菌生长和扩散--荚膜肿胀试验，对本菌鉴定有意义•芽胞抗原：有免疫原性和血清学诊断价值15炭疽毒素：--保护性抗原（PA)、致死因子（LF）、水肿因子（EF）三个组分--单独皆无致病性，与PA结合才显示出致病性--具有抗吞噬和免疫原性16抵抗力：--芽胞抵抗力很强，煮沸10min或干热140℃3h才能杀灭--在干燥土壤中或皮毛中常温下存活数十年致病力不减，牧场一旦污染，传染性可持续数十年--生物武器17--芽胞对化学消毒剂抵抗力不一，对碘和氧化剂较敏感，常用以下方法杀菌：1：2500碘10min、3%H2O21h、4%高锰酸钾15min、0.5%过氧乙酸10min--对磺胺、青霉素、链霉素、四环素、红霉素、氯酶素均敏感18要求快速检出、分离鉴定病原菌，以利早期确诊、查清疫源、及时治疗和采取预防对策三、微生物学检验19标本的采集与处理皮肤炭疽：病灶深部标本肺炭疽：痰和血液肠炭疽：粪、呕吐物脑膜炭疽：CSF、血液死于败血症的动物，严禁宰杀和解剖，可消毒皮肤后割取耳朵、舌尖采集少量血液，局限性病灶可取病变组织或附近淋巴结。20•无杂菌污染标本：直接接种肉汤增菌或固体培养基•污染杂菌固体标本：加10倍量生理盐水充分浸泡，振荡10～15min、静置10min，取悬液65℃水浴30min或85℃5min杀死杂菌，保留芽胞活性，再增菌和培养•污染杂菌液体标本：离心，弃上清液后，加0.5%洗涤剂振荡10～15min，离心取沉淀物增菌和分离培养21生化反应噬菌体裂解青霉素抑制毒力试验检验程序皮毛、腐败脏器等血液Ascoli试验以NG制成悬液经加温或饱和尿素处理肉汤增菌培养BAP或戊烷脒平板2%兔血清肉汤4-8hG染色镜检菌落特征动力观察串珠试验确定报告荚膜肿胀试验22痰、呕吐物、CSF及炎症分泌物2%兔血清肉汤快速增菌37℃4h荚膜肿胀试验直接涂片荚膜染色G染色初步报告0.2ml注射小白鼠腹腔，8h后解剖涂片G染色、荚膜染色初步报告23涂片染色：--G染色、荚膜染色、芽胞染色—初步报告--荚膜荧光抗体染色核酸检测：核酸杂交分离培养：--BAP、戊烷脒多粘菌素B平板--2%兔血清肉汤增菌→分离培养24鉴定试验：形态和菌落特征生化试验:表11-1串珠试验:--接种于含青霉素(0.05～0.5U/ml)的肉汤中，37℃6h，大而均匀成串的圆球状菌体--与青霉素抑制细菌细胞壁合成有关--类炭疽无此现象25•青霉素抑制试验：接种于含青霉素5、10、100U/ml琼脂平板，37℃24h生长受抑制不生长•串珠和青霉素抑制联合试验：兔血琼脂平板抑菌环青霉素纸片26•噬菌体裂解试验：AP631炭疽噬菌体•NaHCO3毒力试验：接种于含0.5%NaHCO3和10%马血清的平板，10%CO2、37℃、24～48h有毒株形成荚膜—黏液型菌落无毒株不形成荚膜—粗糙型菌落•动物试验：小鼠、家兔或豚鼠皮下接种27•植物凝集素试验：•Ascoli热沉淀试验：可作追溯性诊断28第二节蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus,B.cereus)29一、临床意义食物中毒含菌量达105/g以上呕吐型——耐热肠毒素腹泻型——不耐热肠毒素全眼球炎（外伤后）心内膜炎、败血症和脑膜炎30夏、秋季多见食物有米饭、乳品、禽畜肉类、果汁饮料等，大多为加热烹调过的熟食在米饭中极易繁殖，由米饭受污染引起的食物中毒在国内、外均为常见中毒食物大多无腐败、变质现象，感官性状正常，应引起注意31形态与染色：-G+大杆菌-生长6h后即形成圆形芽胞、位于菌体中心或次末端、不突出菌体-菌体两端平截，多数呈链状排列-引起食物中毒的菌株多有周鞭毛、无荚膜二、微生物特性32•培养特性：•需氧或兼性厌氧•营养要求不高•最适温度30~35℃•普通琼脂平板：菌落较大，灰白色，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，有蜡样光泽33BAP—有β溶血卵黄平板—生长迅速，培养3h后，虽看不到菌落，但该菌可分解卵磷脂而形成白色的混浊环，称乳光反应或卵黄反应34•生化反应：•能分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水杨素、糊精，产酸不产气•能胨化牛乳，液化明胶，VP（+）、卵磷脂酶（+）•多次传代后生化特性常可改变35•抵抗力：耐热，肉汤中细菌需100℃20min才能杀死，食物中毒菌株的游离芽胞耐受100℃30min、干热120℃60min才能杀死对氯霉素、红霉素、庆大霉素敏感，对青霉素、磺胺、呋喃类耐药36三、微生物学检验标本采集：可疑食物、粪便、呕吐物，因食品暴露于空气中，在一定程度都会受到本菌污染，所以不能分离出该菌就认为是引起食物中毒的病原菌。37确诊由该菌引起的食物中毒必须：从食物中分离出菌数≥105CFU/g，提示本菌活跃生长，构成潜在危险从可疑食物分离到的菌株与从病人粪便和(或)呕吐物中分离到的菌株属同一血清型38检验程序呕吐物、残留食物等活菌计数接种普通琼脂平板、BAP、卵黄平板37℃18-24h纯培养动物试验（肠毒素测定）生化反应血清凝集（分型）报告结果直接涂片染色镜检39•检验方法：•直接镜检•分离培养与活菌计数普通琼脂平板、BAP、卵黄平板•鉴定与分型：根据菌落特点、形态染色、生化反应等初步鉴定生化分型、血清分型、噬菌体分型，肠毒素检测40第三节产单核细胞李斯特菌和红斑丹毒丝菌41一、产单核细胞李斯特菌（Listeriamonocytogenes)隶属于李斯特菌属42（一）临床意义李斯特菌属有7个种，只有该菌对人和动物致病分布广泛，土壤、水、植物、人和动物粪便中均存在，亦可自甲壳动物、蝇、蜱中分离出能引起多种野生动物和家畜感染（羊、马、狗、猫、鸟、鱼等）正常人粪便带菌率达10%左右，70%的人可短期带菌。新生儿、免疫功能降低者，易受该菌感染43致病物质：李斯特菌溶血素O(LLO)——主要毒力因子内在素——表面蛋白（侵袭性蛋白）磷脂酶C44所致疾病:健康带菌者是主要的传染源污染食物，粪-口途径传播，通过肠道扩散全身胎盘和产道——感染新生儿接触病畜及产品——眼和皮肤的局部感染45•孕妇李斯特菌病•新生儿李斯特菌病•成人李斯特菌病•局部感染46（二）微生物特性形态与染色：G+短小杆菌，形态与培养时间有关-37℃3～6h，菌体主要呈杆状，随后以球杆状为主，3～5天常形成长丝状无芽胞，一般不形成荚膜，在含血清的葡萄糖蛋白胨水中能形成粘多糖荚膜47•20～25℃形成周鞭毛，有动力；37℃时鞭毛很少或无•细菌接种半固体培养基，置室温，由于动力强，细菌自穿刺线向四周弥漫生长，在离琼脂表面数毫米处出现一个倒伞形的生长，是本菌特征之一48培养特性：兼性厌氧菌、生长温度范围广0.5～45℃均生长（4℃冷增菌），最适30～37℃营养要求不高，在含血液、血清、腹水的培养基生长更好BAP—极小的露滴状、侧光微显蓝绿色→灰白色菌落。狭窄的β溶血环萘啶酸选择性平板—细密湿润、边缘整齐的兰色圆形小菌落肉汤——均匀混浊，表面有菌膜49•生化反应：37℃24h，发酵葡萄糖、果糖、蕈糖、麦芽糖和水杨素产酸不产气触酶（+）甲基红（+）VP（+）水解七叶苷、水解精氨酸产氨CAMP（+）50•分型：根据O抗原和H抗原，分4个血清型，1、3、4型可分若干亚型抗原结构与毒力无关，与地理分布有联系与葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、大肠杆菌等有共同抗原51•抵抗力：耐盐、耐碱、不耐酸对热、常用消毒剂敏感多种抗生素敏感，首选氨苄青霉素，青霉素、链霉素、红霉素等也敏感对杆菌肽、多粘菌素耐药52（三）微生物学检验标本采集：血液、CSF、宫颈、阴道、鼻烟分泌物等直接涂片：--在CSF标本中成对排列，形如球菌，易误认为肺炎链球菌--G染色过度脱色形似流感杆菌--有时与类白喉杆菌也极易混淆可用该菌1型和4型及多价荧光抗体染色，同时作动力检查53分离培养：BAP、巧克力平板杂菌污染标本可用20%NaCl心脑浸液肉汤2支1支—10%CO2，37℃24～48h→分离培养（BAP、萘啶酸选择性平板）1支—4℃“冷增菌”→分离培养（每24h一次，共4次，以后每周一次，至少4周）54•鉴定：•形态特征、菌落特点、动力及生化反应作出鉴定•可疑菌落用已知李斯特菌1型、4型或多价抗血清做玻片凝集试验进行鉴定•与其他G+菌鉴别55触酶动力马尿酸盐水解产单核李斯++-B群链球菌--+•本菌有耐碱耐盐的特点，可用触酶试验与肠球菌鉴别56二、红斑丹毒丝菌（Erysipelothrixrhusiopathiae，E.rhusiopathiae）本菌隶属于丹毒丝菌属57（一）临床意义广泛分布于自然界，是许多脊髓动物和无脊髓动物的共生菌或致病菌易感动物有小鼠、猪、鱼、火鸡等主要储存宿主是猪人类可因接触病畜或其产品而感染58毒力与其产生的神经氨酸酶有关，能使细菌粘附至靶细胞从事屠宰、经营鱼类和皮革行业的人员及兽医等感染机会较多通过破损皮肤侵入，引起局限性皮肤病灶，通常称“鱼毒”或“类丹毒”59（二）微生物特性形态与染色：G+杆菌，菌体细长、直或稍弯，单个或短链状，慢性期分离的菌落为粗糙型，常呈长丝状，而且有分支及断裂，与放线菌近似.无荚膜、无芽胞、无鞭毛红斑丹毒丝菌革兰染色1000×60•培养特性:厌氧或微需氧、初次分离需在厌氧环境，传代后有氧环境也能生长，最适温度30-35℃。在含葡萄糖或血清培养基生长旺盛61•BAP：35℃24h可形成两种菌落光滑型：菌落细小、透明突起、发亮、