微生物的实验室培养

专题2:微生物的培养与应用微生物包括哪五类：病毒细菌放线菌真菌原生动物特点：结构都相当简单,个体多数十分微小.通常要用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没有细胞结构.且体内一般不含有叶绿素.不能进行光合作用.原核生物界原生生物界真菌界病毒界微生物基础知识一、基础知识：（一）培养基培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1）按物理状态来分：培养基可分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。其中固体培养基用于菌种分离、鉴定等。（2）按功能来分，可分为选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分来分，可分为天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型和用途培养基的种类液体培养基半固体培养基固体培养基据物理性质分天然培养基合成培养基据化学成分分选择培养基鉴别培养基据用途分常用于工业生产常用于观察微生物的运动、鉴定菌种用于微生物的分离、计数常用于工业生产常用于分类、鉴定在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进所需要的微生物的生长。例如，在培养基中加入青霉素，以抑制细菌、放线菌的生长，从而分离到酵母菌和霉菌。又如，在培养基中加入高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长。根据微生物的代谢特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品配制而成，用以鉴别不同种类的微生物。例如，在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌等细菌：如果有大肠杆菌，其代谢产物就与伊红和美蓝结合，使菌落呈深紫色，并带有金属光泽。标准培养基类型配制特点主要应用物理性质固体培养基加入琼脂较多菌种分离,鉴定,计数半固体培养基加入琼脂较少菌种保存液体培养基不加入琼脂工业生产，连续培养化学组成合成培养基由已知成分配制而成，培养基成分明确菌种分类、鉴定天然培养基由天然成分配制而成，培养基成分不明确工业生，产降低成本目的用途鉴别培养基添加某种指示剂或化学药剂菌种的鉴别选择培养基添加（或缺少）某种化学成分菌种的分离固体培养基：菌落液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长半固体培养基：无动力有动力(弥散)(是否运动)选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物大肠杆菌呈黑色中心,有金属光泽大肠杆菌在伊红美蓝培养基上典型特征鉴定培养基：鉴定所培养生物的类型2、培养基配制原则：•（1）目的要明确：根据微生物的种类、培养目的等确定配制培养基的种类，因为不同的微生物对培养物质的需求不同。•（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。•（3）pH要适宜：各种微生物适宜生长的pH范围不同。•细菌pH为：6.5-7.5；•放线菌pH为：7.5-8.5；•真菌pH为：5.0-6.0。3、培养基的营养构成不管哪种培养基，一般都含有水、碳源、和氮源、无机盐等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。碳源、氮源、生长因子的比较来源常用原料功能碳源CO2、NaHCO3、糖类、脂肪酸、花生粉饼、石油等糖类构成细胞物质和一些代谢产物，有些还是异养做生物的主要能源物质氮源N2、NH3、铵盐、硝酸盐、尿素、牛肉膏和蛋白胨等铵盐、硝酸盐等合成蛋白质、核酸以及含氮的代谢产物生长因子维生素、氨基酸、碱基酶、核酸等的组成成分（二）无菌技术1.无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。成功地培养微生物的关键。无菌技术包括：（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。（１）消毒定义：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）2.消毒与灭菌的概念及两者的区别使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子，而达到完全无菌之过程。灭菌消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。（2）灭菌的定义：比较项理化因素的作用强度消灭微生物的数量芽孢和孢子能否被消灭消毒较为温和部分生活状态的微生物不能灭菌强烈全部微生物能消毒与灭菌的比较1、煮沸消毒法:100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法：70-75℃下煮30min或80℃下煮15min3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源4、紫外线消毒……(1)消毒的方法：3.常用的消毒与灭菌的方法1、灼烧灭菌接种环、接种针、试管口2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸气灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.(2)灭菌的方法：最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。有些玻璃器皿也可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。培养微生物的培养皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。3.微生物实验室培养的基本操作程序1、器具的灭菌2、培养基的配制3、培养基的灭菌4、倒平板5、微生物接种6、恒温箱中培养7、菌种的保存三、实验操作（一.）制备牛肉膏蛋白胨培养基（用于培养细菌）1．计算、称量2．溶化3．调pH：pH7．64．过滤：这一步可以省去。5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6．加塞7．包扎操作步骤8．灭菌:将50ml培养基用玻棒转移至三角锥瓶中，塞上棉花塞，包上牛皮纸，再放入高压蒸气灭菌锅，在压力为100kPa、温度为121℃，灭菌15～30min。将培养皿用旧报纸包裹，放入干热灭菌箱内，在160～170℃下灭菌2h。9．倒平板:待培养基冷却到50℃左右时，在酒精灯附近倒平板。（倒平板操作见课本）2d后观察平板，无杂菌污染才可用来接种.10．无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。倒平板技术1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。（二）、纯化大肠杆菌接种方法有：平板划线法和稀释涂布平板法平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线的操作,将聚集的菌钟逐步稀释分散到培养基的表面.在数次画线后,可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体,这就是菌落.微生物的接种技术菌落：单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。菌落细菌的菌落特征因种而异霉菌的菌落特征因种而异菌落接种环接种针1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。涂布器涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围等等。微生物的恒温培养微生物的恒温培养3．1培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。3．2在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。3．3培养12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。3．4在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。结果分析与评价（P20）四、课题成果评价（一）培养基的制作是否合格如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。（二）接种操作是否符合无菌要求如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，(在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐)则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，(在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。)则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。（三）是否进行了及时细致的观察与记录培养12h与24h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。菌种的保存1、临时保藏法对象：温度：缺点：2、甘油管藏法：对象：温度：频繁使用的菌种4℃（冰箱）容易被污染或产生变异长期保存的菌种-20℃（冷冻箱）课题延伸本课题知识小结:【典例解析】例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是A.是碳源的物质不可能同时是氮源B.凡碳源都提供能量C.除水以外的无机物只提供无机盐D.无机氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHCO3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。答案：D例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是A.防止杂菌污染B.消灭杂菌C.培养基和发酵设备都必须灭菌D.灭菌必须在接种前答案：B解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说