js135201-林宁-分子标记在烟草运用

分子标记技术在烟草中的应用学号：JS135201姓名：林宁专业：作物摘要：DNA分子标记技术研究始于19世纪80年代，是指能够反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段，是DNA水平上遗传多态性的直接反映，是生物分类学、育种学、遗传学和物种起源与进化等研究的重要技术指标之一。随着分子生物学的迅速发展，从DNA双螺旋结构的阐明，PCR技术的诞生，到全基因组的测序，使分子标记技术从蛋白质水平向DNA分子水平逐步深化。本文主要综述了目前经常使用的几种分子标记类型，和它们在烟草种质、品种改良、选择辅助育种等方面的实际运用。关键词：分子标记、烟草、育种、基因烟草(Nicotianatabacum)是最早应用于分子生物学和基因工程研究的植物之一,由于其组织易操作,并具有较强的再生能力,长期以来作为基因工程的模式植物被誉为植物界的“果蝇”[1]。DNA分子标记是DNA水平上遗传多样性的直接反映，DNA水平上遗传多样性表现为核苷酸序列的任何差异。因而，DNA分子标记在数量上几乎是无限的，其主要优点是无表型效应，不受环境影响等。目前，DNA分子标记技术已广泛应用与作物种质资源遗传图谱构建、基因定位和辅助选择育种等方面[2]。1分子标记的种类1.1基于限制性酶切的分子标记RFLP（Restricitionfragmentlengthpolymorphism，限制性片段长度多态性），是由Grodzicker等[3]于1974年创建，80年代中期发展起来的一种最早的分子标记。将DNA用已知的限制性内切酶消化后，产生大小不等的DNA片段，电泳分离、Southern印迹转移到硝酸纤维膜上，用放射性标记探针与膜上变性DNA杂交，放射自显影，显示出不同材料的多态性图谱，RFLP标记呈共显性遗传。1.2基于PCR的DNA分子标记根据所用引物的差异，可分为随机引物PCR标记和特异引物PCR标记，主要包括RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA，随机扩增片断多态性）、ISSR（Intersimplesequencerepeats，内部简单重复序列）和SSR（Simplesequencerepeats，简单重复序列）、SRAP（Sequencerelatedamplifiedpolymorphism，相关序列扩增多态性）[4]、TRAP（Targetregionamplifiedpolymorphism，靶位区域扩增多态性）等分子标记。它们是以DNA聚合酶链反应技术为基础，利用人工合成的核苷酸序列作为引物，以从组织中分离得到的DNA作为模板，通过基因扩增仪合成多态性DNA片段[5]。1.3基于PCR与限制性酶切技术结合的分子标记主要包括AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，扩增片断长度多态性）和CAPS（Cleavedamplifiedpolymorphismsequences，酶切扩增多态性序列）[6]，是由PCR和RFLP技术相结合产生的新技术，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。1.4基于单核苷酸多态性的分子标记单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphisms，SNPs)是指染色体基因组水平上某个特定位置单碱基的置换或插入缺失引起的DNA序列多态性[7]。其中，单碱基的置换是最为常见的类型[8]。SNP被认为是继RFLP和SSR之后出现的第三代分子标记。发现SNP有两种途径：一是对同源DNA片段测序或直接利用现有基因与EST序列，通过序列比对，获取多态性的位点，通过特异PCR扩增和酶切相结合的方法进行检测，二是由于SNP通常表现为二等位多态性，也可直接应用高通量快速的DNA微阵列、DNA芯片等高新技术来发现与检测生物基因组或基因之间的差异[5]。2分子标记在烟草中的运用上述这些新型分子标记具有其独特的优点，目前已在遗传图谱构建、遗传多样性和品种鉴别、分子标记辅助选择育种等方面广为应用。2.1遗传图谱的构建近十几年来，已发展处一系列分子标记方法，其中最主要的是限制性片段长度多态性技术（RFLP），随即扩增的多态性DNA技术（RAPD），串联重复序列（TRS）等[9]。分子标记在构建遗传图谱方面具有方便、快速、密度大等特点，因而在烟草、果树、蔬菜、林木的遗传图谱相继建立。2011年GregorBindler等[10]以HickBroadleaf×RedRussian的F2分离群体为材料，利用SSR分子标记的方法，绘制了包括2363个基因位点、平均遗传距离小于1.5cM的高密度烟草遗传图谱，为烟草遗传研究和比较基因组学的发展提供理论依据和标记基础。2.2遗传多样性和品种鉴别遗传多样性评价和品种鉴定的研究是种质资源保护、开发和利用的基础，利用分子标记可极大地提高这方面工作效率，基于EST发展起来的新型分子标记更具优越性，因为它是对基因内部变异的一种直接评价，有可能和形态、生理生化特征或某个特定的环境适应型相联系[6]。刘艳华等[11]利用SRAP分子标记技术对黄花烟、普通烟草选育种质、引进种质和地方种质进行分析，结果表明，我国烟草地方种质遗传多样性最丰富，目前烟草育种中利用的亲本遗传基础狭隘。许军等[12]利用SSR标记构建了烟草核心种质中普通烟草的指纹图谱。从286对SSR引物中筛选出8对多态性较好的引物，对这些烟草种质进行分析，结果表明，这8对多态性SSR引物可以将381份烟草种质完全区分开，每份种质都有各自独特的指纹图谱，为烟草新品种鉴定、种质编目提供了理论依据和技术支持。2.3分子标记辅助选择育种分子标记辅助选择育种是把分子标记技术运用于育种过程中，通过分析与目的基因紧密连锁的分子标记的基因型来进行育种，是直接在DNA分子上进行的选择，该技术不受环境条件的影响，提高了选择的可靠性。以下介绍两种常用的方式：杂交育种和抗病育种[6]。2.3.1杂交育种在杂交育种中，亲本选配必须考虑的一个重要因素是确定亲本的亲缘关系。利用分子标记的方法可以快速准确地鉴别出杂交亲本间的亲缘关系。王涛等[13]利用RAPD和ISSR标记技术对30份烟草种质资源进行了遗传多样性分析，研究显示，野生种和栽培种之间存在较大的遗传差异；亲缘关系的远近与其遗传相似性有关，而与烟草栽培种的调制类型差异无关。2.3.2抗病育种利用与抗病基因连锁的分子标记，可以在育种的早期进行辅助选择，无需保存大量的植株，可降低工作量，提高抗病育种效率。从国内外文献资料来看，在烟草研究中得到较多应用的DNA分子标记技术有RAPD和RFLP等，已报道的烟草抗性基因的分子标记主要还是RAPD标记。郭生云[14]等报道由引物S220得到了一个抗病品种所共有，而感病品种没有的约760bp的DNA片段，可作为与烤烟抗赤星病基因紧密连锁的RAPD标记。Johnson[15]等找到了与烤烟品种Coker371-Gold的黑胫病抗性基因Ph连锁的RAPD标记。徐秀红等[16]以含有来源于N.longiflora的抗病基因的品种Ky14和感病品种SpeightG-140为亲本，利用BSA法对抗病基因进行了RAPD分析。从423个引物中筛选到一个与抗病基因紧密连锁的RAPD标记S522000，标记与基因间的遗传距离为4.88cM。3前景与展望综上所述，分子标记技术在改善烟草遗传图谱、种质资源，辅助选择育种等方面发挥了极大的作用，并也取得了很有价值的研究，但目前基因组学研究的重心进入了以“功能基因组”为主要内容的“后基因组时代”[5]，利用目前烟草基因组测序获得的序列信息，通过表达序列标签（EST）序列成为开发以PCR为基础的新型分子标记的主要资源，这些新的、高效的、特异的现代标记技术建立在经典的标记技术基础之上，并不断完善和扩充，技术手段由粗放向精细准确转变，检测仪器的种类和精度也逐渐提高，使其多态性丰富的优点得以体现[6]。挖掘、开发SNP、EST-SSR以及CAPS等新型分子标记，结合DNA提取程序化、电泳胶片分析自动化、信息（数据）处理计算机化等技术必将促进烟草重要性状基因克隆、分子标记辅助育种以及品种鉴定等研究工作的快速发展。参考文献[1]代晓燕，苏以荣，范业宽，等.基因工程技术在烟草研究中的应用现状与展望[J].广西农业生物科学.2006，25(7)：1-2[2]王志德，牟建民，戴培刚，等.部分烟草核心种质RAPD分析[J].中国烟草学报，2003，9（4）：1-3，20-26[3]BosteinD,WhiterL,SkdnickM,etal.Constructionofageneticlinkagemapinmanusingrestrictionfragmentlengthpolymorphisms[J].Am.J.Hum.Genet.,1980,32:314-331[4]LinZ,HeD,ZhangX,eta1.LinkagemapconstructionandmappingQTLforcottonfibrequalityusingSRAP,SSRandRAPD[J].PlantBreeding,2005,24(2):180-187[5]刘艳华.烟草基因组学研究方法篇：4.烟草分子标记技术及其应用[J].中国烟草科技，2011，（8）：1-2[6]赵雪，谢华，马荣才.植物功能基因组研究中出现的新型分子标记[J].中国生物工程杂志，2007，27（8）：104-110[7]GargK,GreenP,NickersonDA.Identificationofcandidatecodingregionsinglenucleotidepolymorphismsin165humangenesusingassembledexpressedsequencetags[J].GenomeRes,1999,9(11):1087-1092[8]杨昭庆，洪坤学，褚嘉佑．单核苷酸多态性的研究进展．国外医学遗传学分册，2000,23（1）：4-8[9]陈学平，朱显灵.分子生物技术在烟草改良中的应用[D].合肥经济技术学院，19971（3）：2[10]GregorBindlerJP,NicolasBakaherIG,NikolaiIvanovRV,eta1.Ahighdensitygeneticmapoftobacco(NicotianatabacumL.)obtainedfromlargescalemicrosatellitemarkerdevelopment[J].TheorApplGenet,Pulishedonline:02April2011[11]刘艳华，王志德，牟建民，等.不同烟草群体间遗传多样性分析[J].中国烟草科学，2009，30（增刊）：19-24[12]许军.烟草核心种质SSR指纹图谱构建及遗传多样性分析[D].北京：中国农业科学院研究生院，2011[13]王涛.烟草遗传多样性与亲缘关系的RAPD和ISSR分析[D].福州：福建农林大学，2005[14]郭生云，何川生，张汉尧，等.用RAPD技术鉴定烤烟抗赤星病基因连锁标记[J].海南师范学院学报(自然科学版)，2001，14(2)：10-13[15]JohnsonES,WolffMF,WernsmanEA,etal.Originoftheblackshankresistancegene,Ph,intobaccocultivarCoker371-Gold[J].PlantDisease,2002,86(10):1080-1084.[16]徐秀红，王元英，王洪钢，等.烟草野火病抗性基因的分子标记与辅助选择[J].中国烟草学会论文集，2005：50-56