KAPA酶

KAPA高保真酶1.产品说明KAPA高保真热启动DNA聚合酶是一种新型的单酶体系，与其他高保真酶相比具有行业领先的性能。该酶扩增基因组可达15kb，扩增质粒或噬菌体DNA可达18kb。热启动配方中，酶是结合在一个特定的载体上，使其在第一步变性之前一直保持灭活的状态。这样就消除了反应设定和启动过程中非特异性启动导致的产物扩增，进而增加了整体反应的效率和灵敏度。KAPA高保真热启动DNA聚合酶试剂盒包括两种buffer，分别用于常规模板和高难度模板。试剂盒成分：a.KAPA高保真热启动DNA聚合酶;b.5×KAPA保真缓冲液（含Mg离子）；c.5×KAPAGC缓冲液（含Mg离子）；d.25mMMg离子；e.KAPAdNTP混合体系。2.应用范围KAPA高保真热启动DNA聚合酶适用于高保真PCR，产物克隆用于下列应用：a.基因定点突变b.测序c.蛋白表达3.背景合成能力被定义为聚合酶每个结合单位合成的核苷酸数量，同时也是延伸速度和稳健性的主要决定因素。相比于融合技术将DNA结合蛋白链接到Pfu-like聚合酶来提高合成能力，KAPA高保真热启动DNA聚合酶经过基因工程改造，增加了DNA的亲和力，而不需要辅助蛋白质域。这种内在的高合成能力导致产量、灵敏度、速度、模板长度以及对困难模板扩增能力的显著提升，当执行高保真PCR时，在产生足够的产物用于克隆的前提下减少循环数是很重要的。额外的循环数增加了产量却降低了保真性：反应早期少量的错配都是固定的，此后在每一个连续循环中都得到放大。在随后的周期，任何额外的错误都将导致突变扩增的比例增加。请注意KAPA高保真热启动酶的循环温度和时间参数与其他的非工程高保真聚合酶比如Pfu或Vent都是不同的。酶KAPA高保真热启动酶Pfu酶Taq酶来源工程酶嗜热古细菌水生栖热菌错误率2.8x10-72.2x10-62.6x10-5延伸速率（nt/sec）50-752561合成能力（nt）**1002042**合成能力定义为一分子的DNA聚合酶在催化反应中延伸的核苷酸数量。4.反应设定下表列出的标准反应条件在大多数情况下都能得到满意的扩增结果。对特别的引物/模板的结合或应用，进一步优化需通过不同浓度的酶、Mg离子、模板和/或引物来获得。KAPA高保真缓冲液含有2.0mM浓度的Mg离子。对于有些特别的引物或模板可能需添加额外的Mg离子。通过设定一个Mg离子梯度的PCR来获得最优的Mg离子浓度，Mg离子浓度按0.25mM的量增加或减少。建议每个实验设置一个阳性对照和阴性对照。对于阳性对照，用已知模板的DNA来获得特殊引物对的阳性结果。1）对于25ul体系，推荐反应体系：PCR水定容至25ul5×HiFibuffer或GCbuffer（1×）5uldNTP混合体系（0.3mM）0.75ul正向引物（0.3uM）0.75ul反向引物（0.3uM）0.75ul模板DNA（≤50ng基因组DNA，≤50ng质粒或噬菌体DNA）根据需要KAPAHiFi高保真酶（0.5u/25ul体系）0.5ul终体积25ul2）混匀，微离心，使反应成分沉到PCR管底部。立即开始热循环。5.循环参数步骤温度时间循环数热启动95℃2-5min1变性98℃20s15-35退火Tm+/-10℃15s延伸72℃30s/kb最终延伸72℃1-5min1注意事项：1）KAPAHiFi反应缓冲液中盐离子浓度较高，影响DNA变性/退火，所以复杂模板需要较长的其实变性时间，5分钟。2）每个循环中变性条件为98℃20s。3）最佳退火温度需通过梯度PCR优化得到；4）推荐延伸时间：30s/kb。5）对大多数的高保真应用推荐25个或更少的循环数，若起始模板浓度低或扩增效率偏低导致产量不高，可增加至30-35个循环。6）该体系可扩增≥10kb的目的基因片段，低目的基因拷贝数和/或特殊引物/模板结合依赖于Mg离子浓度。Mg离子浓度的优化，需设定梯度PCR实验，每次增加或减少0.25mM。7）根据实验要求可调整HiFi酶的浓度，范围：0.25U-1.0U/25ul。6.附加指南6.1KAPAHiFi缓冲液KAPA高保真热启动PCR试剂盒中含有两种5×缓冲液，保真缓冲液和GC缓冲液。保真缓冲液用于大多数反应。GC缓冲液是为高GC含量和/或稳定的二级结构的扩增/模板制定的，在保真缓冲液产量很低的情况下推荐使用。两种缓冲液都含有2.0mM浓度的Mg离子。使用GC缓冲液时，保真性有双重的降低。6.2扩增长度质粒和噬菌体DNA的扩增长度为18kb，基因组DNA为15kb。若要有效扩增得到长度≥10kb的基因组DNA，就需要提高模板浓度，优化Mg离子浓度。6.3模板DNA扩增复杂度不高的模板如噬菌体或质粒DNA比较简单，也不怎么需要进行条件优化。对于拷贝数比较低目标的扩增难度则更大。对于质粒和噬菌体DNA25ul的体系中加5ng的模板一般就足够了，而基因组DNA或cDNA则需要50ng的模板量。模板DNA的质量对PCR的结果具有显著的影响。当扩增目标1kb，DNA的退化、损坏或剪切是特别的问题。用TE或10mMTris稀释和储存DNA，同事最小化冻融周期以减少退化和保持质量。高质量的模板DNA对于高保真PCR是至关重要的。6.4延伸时间KAPA高保真热启动酶能够以30sec/kb的速率扩增长达18kb的目标产物。特殊的情况下延伸时间可以进一步优化。如果模板的量足够的话延伸时间是可能减少延伸时间，而延伸时间的延长可以导致灵敏度和/或产量的显著增加。6.5引物和退火温度引物设计对成功的PCR扩增来说是至关重要的。引物的GC含量应在40-60%之间。引物的GC含量大于60%可能导致变性温度的增加和/或变性时间的增长。引物对之间应该有相似的熔化温度（Tm）。两步循环程序中的引物设计应该有较高的Tm值，确保在一个温度（65-72℃）有效的退火和延伸。第一步，用计算出的最低Tm值作为引物对的退火温度。为了增加灵敏度，每次降低1℃的退火温度来调整；为了提高特异性，每次升高1℃的退火温度来调整。有几种方法用来调整引物的预测Tm值。推荐使用最近邻法，它需要引物序列以及其他的变量（盐浓度和DNA浓度等）。最常用的计算寡聚核苷酸Tm值的方法是基于A、T、G、C碱基的数量：Tm(℃)=2(nA+nT)+4(nG+nC)。请记住一个给定引物的试剂Tm值是受特定反应条件的影响的，包括反应缓冲液，DNA浓度，变性剂的存在以及核苷酸修饰等。因此建议最佳的退化温度需要通过一个退火温度梯度PCR来决定。6.6dNTPs校正聚合酶的成功扩增高度依赖于dNTPs的质量，即使存在非常少量的dUTP也会有很大的影响。使用试剂盒中提供的KAPA高质量的dNtps。建议的0.3mM浓度的dNTP对所有的标准扩增都是足够的，且已经用18kb的产物验证过了。6.7Mg离子浓度两种缓冲液都含有2.0mM浓度的Mg离子。这对于大多数的应用来说都是足够的。特殊的应用，特别是10kb长度的基因组模板的扩增，就需要对Mg离子浓度进行条件优化。进行Mg离子浓度梯度PCR，每次增加或减少0.25mM浓度的Mg离子。6.8TA克隆KAPA高保真热启动酶得到的DNA片段适合平端克隆。对于TA克隆，在最后延伸步骤温度为72℃时，dA突出端被加到平端PCR产物上。在尾端加A之前纯化PCR产物是十分重要的。如果不这么做，KAPAHiFi高保真热启动酶的校正活力将退化dA突出端。7.疑难问题与解答问题可能原因解决方案目的片段过长；减少目的片段大小，扩增最大片段长度：基因组DNA15kb，质粒或噬菌体DNA为18kb；高GC或存在使用GC缓冲液；无产物DNA二级结果；模板其实浓度过低；模板需要量：质粒或噬菌体DNA≥5ng，基因组DNA为50ng，若模板量无法增加，则增加循环数；Mg离子浓度过低。梯度优化Mg离子浓度，每个梯度增加0.25mM。电泳结果弥散模板浓度过低；模板需要量：质粒或噬菌体DNA≥5ng，基因组DNA为50ng，若模板量无法增加，则增加循环数；退火温度过低；提高退火温度；高GC或存在DNA二级结构；使用GC缓冲液；模板降解或破坏；确保模板DNA提取/保存方法正确。DNA保存于TE或10mMTris，减少反复冻融数；Mg离子浓度过高。试剂盒配套的两种buffer中都含有Mg离子，一般不需要额外添加；产量低模板浓度过低；模板需要量：质粒或噬菌体DNA≥5ng，基因组DNA为50ng，若模板量无法增加，则增加循环数；高GC或存在DNA二级结构；使用GCbuffer；Mg离子浓度过低；梯度优化Mg离子浓度，每个梯度增加0.25mM；dUTP污染；使用高质量的dNTPs；引物浓度过低。推荐引物终浓度为0.3uM，扩增长片段需要相对较高的引物浓度。