microRNA作为靶点在药物设计中的应用

microRNA作为靶点在药物设计中的应用摘要：微小RNA（microRNA）是一类长约22bp的非编码单链RNA，由前体经酶作用而得，它是细胞的内源性物质，普遍存在于动植物中，高度保守，在生命体的生长、发育、疾病发生发展的过程中起到了基因调控作用，它与重大疾病，如肿瘤、心脏疾病、神经性疾病等都有着密切的关联，因此成为新药开发的一个重要新靶点，以它为靶点的药物设计和药物研发工作也在不断探索中。本文就其作用机制、生物功能、与疾病的关系以及以microRNA为靶点的药物设计的研究情况进行了综述。关键词：microRNA；靶点；药物设计1993年Lee等[1]在对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditiselegans）进行遗传分析时发现了第一个microRNA——lin-14，它的长度为22bp，它是一个非编码的单链RNA，可以控制细胞的发育，通过反义的RNA-RNA反应在转录后水平下调lin-14蛋白的表达。2000年reinhart等[2]发现了第二个microRNA——let-7，它在线虫的发育过程中可以下调lin-28和lin-41的表达。2001年Lee等[3]通过cDNA克隆和对生物资料的分析，在秀丽隐杆线虫中又发现了15种新的microRNA，其中有3种在哺乳动物以及昆虫中有明显的同系物。同年Lau等[4]也报道了55种之前在线虫中不知道的microRNA，其中一些在果蝇和人类的基因组中也有发现。Lagos-Quintana等[5]在2001年报道microRNAs存在于脊椎和无脊椎动物中。microRNAs广泛存在，高度保守及其表达方式，都说明它在动物中具有广泛的调节功能。因此在随后的研究中，许多的实验室相继发现了更多的microRNAs，这使得其家族迅速扩增，到2003年就已经有200多个成员了[6～10]。到2010年，在人体内确认存在的microRNAs有800多个。有研究表明microRNA可能与疾病发生有密切的关系，在不同类型疾病的发生过程中，microRNA的水平及其调节作用是不同的。鉴于microRNA的重要性，本文归纳了近年来在该领域研究中的关键问题，总结了microRNA的作用机制及其作为小分子药物作用靶点研究的主要进展，其在疾病发生发展过程中的重要性及潜在应用前景，以此为线索，对设计合成新一类基因治疗药物的研究前景进行了展望。1microRNA的作用机制及其生物学功能microRNA是一个长度为18～26个核苷酸的小分子单链非编码RNA，是生物体内源基因转录形成分子内或分子间双链结构后，经RNAseⅢ酶、DGCr/Pasha以及Dicer酶作用产生。大多数microRNA由位于基因间隔区的核苷酸序列编码，转录方向与相邻的基因往往相反。另一类位于基因内含子中的microRNA，随着基因mRNA转录而包含在mRNA的前体中，转录方向与对应的基因一致，此类microRNA的表达具有组织特异性[11]。microRNA广泛存在于生物中，它是一个重要的基因调节子。microRNA的功能遍布生命体的发生、生长、发育、分化、信号转导、疾病和死亡的各个阶段。多种microRNAs在细胞内的表达，使得细胞处在一个受内源性microRNA调节的环境中，维持着细胞内mRNA的水平，从而使各种蛋白质的水平处于一个正常范围。因此microRNA与许多疾病有着密切的关系。但是，由于每个microRNA具有调节数百甚至数千mRNA的能力，导致microRNA作用缺乏基因特异性，这在一定程度上阻碍了其作为基因诊断和治疗靶点的应用。有趣的是，在心脏、脑、肝脏等不同的组织中，都有特异性microRNA占主导地位，提示其在组织分化过程中发挥重要作用[6]。目前已有证据提示在包括癌症在内的一系列人类疾病中microRNA可能是新的治疗靶点。2microRNA与疾病的关系2．1microRNA与肿瘤microRNA与多种肿瘤的形成、癌症发生都有着密切的关系。Calin等[12]发现在慢性淋巴细胞白血病中mir15和mir16双双下调。Lu等[13]报道从microRNAs的表达谱可以区分出低分化的肿瘤，这一现象也说明microRNAs与肿瘤的分化有关联。另外研究也证明microRNA与癌症（如乳腺癌）的转移也有关联，在乳腺癌的恶化进程中起到促进或抑制作用。He等[14]指出microRNA可以调节肿瘤的形成，而且暗示mir17-92簇是一个潜在的人类致癌基因。另外Satzger等[15]提出mir-15b与恶性黑色素瘤的增殖和凋亡都是相关的。Nakano等[16]通过功能筛选得到了microRNA491，它在结肠直肠瘤细胞中以bcl-X(L)为靶点诱导细胞的凋亡。这些实验结果都很好证实了microRNA与肿瘤有着密切的关系，它可以作为一个检测和治疗肿瘤的靶点。由于最近提出的原癌microRNA组学(Oncomirs)[17]这一崭新概念，将调节microRNA的小分子物质应用于肿瘤细胞的研究具有很大潜力，这一理论假设具有一定的事实基础，因为microRNA可调节很多与真核生物生存和增殖密切相关的基因，且microRNA是完全天然的内源性反义调节因子。另外，Meng等[18]首次报道了应用化疗药物作用于人类癌细胞可影响microRNA的表达，该研究发现给予gemcitabine(2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷)可改变microRNA的表达，体外调节某些microRNA(例如上调miR-21)还可增加胆管癌细胞对该化疗药物的敏感性。以上结论为microRNA作为肿瘤治疗靶点提供了实验基础。最近还有研究表明microRNA具有肿瘤抑制因子和原癌基因的功能。与应用可编码蛋白质的基因作为癌症分型方法相比，应用microRNA更加精确，不同肿瘤细胞表达的某一特定microRNA，其不同的表现形式可能成为诊断和治疗肿瘤的有利工具。基于microRNA的基因治疗可能成为抑制肿瘤恶化的有效途径。例如le-t7，在肺癌[19]及结肠癌[20]细胞中其表达量降低，研究表明其可下调Ras和c-Myc蛋白表达，因此可转染le-t7从而抑制上述两种肿瘤细胞的生长；但在胆管癌细胞中，Meng等[21]通过转染技术使白细胞介素-6(IL-6)过表达，则le-t7a表达水平也相应升高，已知IL-6可促进肿瘤细胞生长并抵抗化疗药物作用，该研究组发现le-t7a的靶基因是neurofibromatosis2，而该基因的表达产物可调节信号传导与转录活化因子-3(signaltransducersandactivatorsoftranscription，Sta-t3)的磷酸化过程，即IL-6表达水平持续增高并维持肿瘤细胞生长的过程中，le-t7a抑制抑癌基因neurofibromatosis2的表达，导致Sta-t3磷酸化作用增强并启动肿瘤细胞生存通路，因此，在这类肿瘤细胞中应抑制le-t7a的表达。而miR-15和miR-16对BCL-2具有负性调节作用并诱导白血病细胞凋亡[22]，它们都可能成为肿瘤治疗的候选分子。2.2microRNA与心脏疾病2002年，Lagos-Quintana等[6]克隆了成年小鼠不同组织的microRNA，其中miR-1和miR-133在心肌组织表达量最为丰富，且具有一定组织特异性，说明两者在原始细胞向心肌细胞发育的过程中发挥重要作用。Chen等[23]验证了miR-1和miR-133在心肌和骨骼肌的表达，并研究了两者在肌细胞增殖和分化过程中发挥的功能。miR-1和miR-133在小鼠2号染色体和18号染色体均成簇表达，且同时转录。研究人员检测了胚胎鼠、新生鼠和成年鼠骨骼肌miR-1和miR-133的表达，发现伴随发育进程，两者的表达量逐渐增多。进一步研究发现两者发挥的功能却截然不同，miR-1促进肌原细胞分化，而miR-133可刺激肌原细胞增殖，说明两者在骨骼肌和心肌表达的时向性和数量，对于骨骼肌和心肌的不同时期发育过程具有重要作用。近年来，对不同病理条件下心肌microRNA的研究逐渐增多。Zhao等[24]应用基因敲除技术研究miR-1-2在小鼠心脏发育过程中的作用，发现敲除miR-1-2基因的小鼠死于先天性室间隔缺损的几率大大增加，可能与调节心脏发育的转录因子Hand2过表达有关；另一些存活的小鼠则由于出生后心肌细胞持续分裂而导致心肌肥大并伴有心律失常，miR-1-2的靶基因Irx5表达异常增高，而Irx5可抑制Kcnd2基因，使K+通道亚单位Kv412表达减少，心肌细胞复极异常。心肌肥大是一种多基因遗传病，但其发病机制尚不明了。VanRooij等[25]应用转基因动物和离体心肌细胞两种心肌肥大模型，发现并验证了7种上调的microRNA(miR-21、miR-23、miR-24、miR-125b、miR-195、miR-199及miR-214)和4种下调的microRNA(miR-29c、miR-93、miR-150以及miR-181b)。对于心肌肥大引起的心衰，上调的microRNA与心肌肥大相似，提示它们可能参与调控心肌组织的病理性重塑过程。进一步研究证实，过表达miR-195不但可以使体外培养的心肌细胞肥大，还可使转基因动物产生心肌肥大，表现为左心室壁薄，左心室内径增大以及心功能降低，并最终导致心衰。Sayed等[26]同样研究了microRNA与容量负荷所致心肌肥大的关系。在众多microRNA中，miR-1表达量下降。与在骨骼肌中的作用相似，miR-1受SRF调节，随年龄增长，其表达增多，心脏不再生长，但当其受多种因素影响而下调时，则可导致心脏的肥大，推测其作用靶点可能是RasGTP酶-活化蛋白(RasGTPase-activatingprotein，RasGAP)、周期素依赖性蛋白激酶9(cyclin-dependentkinase9，Cdk9)、脑内Ras同系物(Rashomologenrichedinbrain，Rheb)以及纤维结合蛋白(fibronectin)。伴随心肌肥大过程，miR-21上调，该microRNA具有抗凋亡活性，是肿瘤发生发展过程中的活跃分子。心脏负荷过大可导致凋亡，初期，心脏可通过使心肌细胞变肥大和激活抗凋亡通路产生补偿机制，miR-21的上调可产生强大的抗凋亡作用，因为其可同时调节多种凋亡基因，预测其作用位点为Fas配体(Fasligand)和转化生长因子-B受体(transforminggrowthfactor-Breceptor，TGF-Breceptor)。2.3microRNA与神经系统疾病microRNA参与调控神经系统的生长发育和生理功能。它与突触生长和可塑性障碍相关的疾病发生有关。Schratt等研究发现mir-134参与调节树突棘发育、成熟和可塑性[27]。哺乳动物脆性X智力低下蛋白（FMrP）能够与microRNA和与之相关的Dicer酶以及AG01蛋白分子结合，通过microRNAs来调节神经元的传输。不仅如此，目前研究较多的神经退行性疾病也与microRNA相关。在患有神经退行性疾病的患者体内，mir-9、mir-125b和mir-128都被发现有下调的现象。mir-8的直接底物是阿托品，mir-8的突变体可以提高阿托品的活性，结果导致果蝇脑内神经元的凋亡以及行为的缺失[28]，表明microRNA-8与体内的阿托品的调节是相关的。microRNA与其他的神经疾病也密切相关，如mir-383和mir-132分别和血管源性脑水肿相关的两种蛋白AQP4，MMP9的表达变化一致。3以microRNA为靶点的药物设计3.1microRNA作为药物靶点因为microRNA与许多重要的疾病有着密切的关联性，所以microRNA已经成为人们关注的焦点。它作为药物研发的重要靶点，可设计相应的药物，通过上调或下调microRNA或使基因沉默等来达到治疗目的。目前，基于microRNA的分子药物设计尚处于起步阶段，研究主要集中于模拟microRNA，增强其对靶基因的作用效能，或以