角蛋白的生物降解

角蛋白的生物降解作者：徐升胜导师：崔为正日期：2005.4.11角蛋白的来源角蛋白（keratin）是一种纤维状蛋白质（fibrousprotein），它来源于外胚层细胞，包括皮肤及其衍生物，是外胚层细胞的结构蛋白。角蛋白的分类地位在按分子结构的分类中，角蛋白属于单纯蛋白中的硬蛋白（scleroprotein）在按生物学功能的分类中，角蛋白属于结构蛋白（structuralprotein）角蛋白的分类α－角蛋白是毛发中的主要蛋白质β－角蛋白是蚕丝和蜘蛛丝的一种主要蛋白质α－角蛋白拉伸两倍，既可形成β－角蛋白，外力撤消后回复。天然β－角蛋白不能转化为α－角蛋白α－角蛋白的结构氨基酸序列是由富含α－螺旋的中央棒状区和两侧的非螺旋区构成。α－螺旋轴向大体上与角蛋白的长向平行。在毛发α－角蛋白中，三股右手α－螺旋向左缠绕拧成一根称为原纤维（protofibril）的超螺旋结构，原纤维再排成“9+2”的电缆式结构，称为微纤维（microfibril）。成百根微纤维再结合成一不规则的纤维束，称为大原纤维（macrofibril），它是毛发的结构单元。β－角蛋白的结构丝心蛋白是典型的反平行的β－折叠片结构，多肽链取锯齿状折叠结构，在这种构相中侧链交替的分布在折叠片的两侧。链间主要以氢键连接，层间主要依靠范德华力维持。角蛋白生物降解的研究历史1899年Ward报道了真菌马爪甲团囊菌(Onygenaequina)能分解角蛋白1963年Nickerson等将具有分解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶（keratin）降解角蛋白的微生物－细菌1990年Williams等报道,从实验室废水消化器中富集分离到一株能利用羽毛的地衣芽孢杆菌PWD-11993年Atalo和Gashe分离到一株能降解不同纤维性蛋白的嗜热杆菌P-001A1996年Frederich报道分离到一株利用羽毛角蛋白的嗜热厌氧菌闪光杆菌降解角蛋白的微生物－放线菌1993年丁正民等从鸡毛堆肥中采样,分离纯化到一放线菌菌株SS-1,发酵5d就不见成形鸡毛。1999年Chitte等报道分离到一株降解羽毛角蛋白的嗜热链霉菌SD8。1997年BrigitteBockle利用链霉菌降解羽毛,4d内达6.7g/L。降解角蛋白的微生物－真菌1980年Jain和Agrawal研究发现Verticilliumtenuips和Trichopytonequinum有较高的羽毛降解能力。1993年罗文等从土壤中分离出一株能降解羽毛粉角蛋白的霉菌,初步鉴定为串孢属菌(Catenu-lariasp.)。1995年Singh等研究了21种真菌,发现其中Trichophytonsimii降解羽毛角蛋白的能力最强。1996年Santos[10]报道了分离到降解羽毛角蛋白的曲霉(Aspergillusfumigatus)。地衣芽孢杆菌PWD-1(一)分离材料利用喜温微生物消化禽类废弃物生产沼气的消化器产生的费液。培养基（g／L）NH4Cl0.5；NaCl0.5；K2HPO40.3；KH2PO40.4；MgCl·6H2O0.1；酵母粉0.1；琼脂20；pH7.5；羽毛粉末地衣芽孢杆菌PWD-1(二)将反应器产生的费液接种在浸有羽毛的基础盐培养基中，在50℃条件下培养7～10天，羽毛严重降解后，转接到新的培养基中。连续转接多次，大约经过数月时间。在营养琼脂上分离，至少得到两种在形态上不同的菌落。其中一个为杆菌；另一个为球菌。虽然两者都有降解角蛋白的活性，但以杆菌的降解活性为强。地衣芽孢杆菌PWD-1（三）有活性的微生物在500ml含有1％羽毛的基础盐培养基中发酵三天，用四层粗棉布过滤，所得细胞溶于基础盐，接种于10ml含有1％羽毛的培养基。分别于有氧或无氧条件下培养。该微生物在无氧条件下有更强的羽毛角蛋白降解活性。降解角蛋白的酶1992年XiangLin等报道,从地衣芽孢杆菌PWD-1菌株降解羽毛的培养液中提取到一种角蛋白酶。1995年Bockle等报道,从角蛋白降解菌密旋链霉菌提纯到一种丝氨酸蛋白酶。1996年Friedrich报道:从嗜热厌氧菌闪光杆菌中,纯化到一种角蛋白酶。1999年Lgnatova等报道,从嗜热放线菌中提纯的一种单体角蛋白酶。角蛋白酶的纯化（一）用玻璃丝过滤，除去未降解的角蛋白等固形物。用0.45μm孔径的滤膜过滤除去菌体及细胞碎片等。所得滤液用截留分子量为10，000的透析膜透析。角蛋白酶的纯化（二）用羧甲基纤维素进行柱层析先用pH5.8的磷酸盐缓冲液平衡。加样量为50mg，依次用pH5.8、6.2、6.8的磷酸盐缓冲液进行洗脱。洗脱温度为4℃，速度为0.4ml／min。每5ml收集一份。洗脱过程中通过A280进行检测。角蛋白酶的纯化（三）用交联葡聚糖G－75进行柱层析对于收集到有蛋白酶活性的部分，用截留分子量为10，000的透析膜透析后，用交联葡聚糖G－75层析，洗脱液为pH7.0的50mM的磷酸盐缓冲液，洗脱速度为0.3ml／min。洗脱温度为4℃。每3ml收集一份。蛋白酶活性的检测牛奶－琼脂糖碟法将1g琼脂溶于98mlpH7.5的0.5mM磷酸盐缓冲液中，当温度降到60～70℃时，加入2ml煮沸过得牛奶。迅速倒入20×20cm的玻璃碟中，充分凝固后81个直径为5mm的小孔。加入25μl的洗脱液，37℃保温过夜或50℃保温2h。角蛋白酶活性的鉴定磺胺化角蛋白法将经过球磨的角蛋白与对氨基苯磺酸和亚硝酸钠混合制备磺胺化角蛋白。将5mg磺胺化角蛋白加入到1.5ml的离心管，充分溶解后，加入0.2ml酶溶液，50℃水浴，加入0.2ml10％的三氯乙酸终止反应，测A450，反应15minA450增加0.01为1U。游离氨基酸的检测反应底物：酪蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白和牛血清蛋白。反应体系：5mg底物，0.8ml缓冲液，0.2ml酶溶液（含8μg纯酶）。反应检测：离心或过滤去除固形物后，取0.5ml加入水合茚三酮溶液显色。试验结果：这些底物均能被纯化到的酶水解。酶性质鉴定天然角蛋白酶分子量的测定，采用葡聚糖凝胶G－75柱层析法。亚基分子量的测定，采用SDS－PAGE电泳法。考马斯亮蓝R－250显色。为决定是否含有补体，进行紫外－可见全波段扫描。是一单体酶，分子量33kDa。角蛋白酶的分子生物学1994年XiangLin等报道,编码地衣芽孢杆菌PWD-1产的丝氨酸蛋白酶的结构基因kerA的核苷酸序列。kerA基因同编码地衣芽孢杆菌NCIMB6816菌株的SublitisinCarls-berg基因的序列相似性为97%。这两种细菌的启动子、核糖体结合位点和转录终止子也相似。推测的氨基酸序列表明这两种蛋白酶只有三个氨基酸不同。Northern(RNA)分析证明kerA在转录水平受到调控。酶氨基酸序列的测定完整的或经过CNBr裂解的酶，进行SDS－PAGE电泳，并eletrotransferredontopolyvinylidenedifluoride膜上。通过埃德曼降解技术测定酶分子N端的氨基酸序列。PWD－1核酸的提取基因组DNA的提取采用经典方法提取基因组DNA，并利用CsCl梯度离心进行纯化，回溶于双蒸水。全RNA的提取采用Ausubel发展的方法提取于营养肉汤或加入羽毛角蛋白的基础盐培养基培养的菌体的全RNA。PCR底物的设计通过比较该角蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶的N端序列，推测出该角蛋白酶基因5‘端66个碱基的序列以1～10碱基为正向因为，同时和一随机引物扩增下有序列以45～35碱基的互补序列为反相引物，与一随机引物扩增上游序列。PCRscreeningofλclonesPWD－1的基因组DNA经限制性内切酶Sau3A1作用后，整合到通过XhoI切开的λ质粒上。利用N25（4～24）和T7或SP6做底物。进行PCR。Southern和Northern杂交N25核苷酸序列的5端用32P标记，PCR产物加样于琼脂糖凝胶上电泳，然后转印到尼龙膜上，60℃至少16h。从含羽毛角蛋白培养基培养的菌体中提取的RNA，在含6％甲醛的1％琼脂糖凝胶上电泳，转印到尼龙膜上，与5端标记32P的PCR产物杂交。测序PCR产物和通过PCR筛选的λ克隆，转入到pCRⅡ质粒中，导入大肠杆菌。利用经典方法进行测序。角蛋白酶的固定固定于succinamidopropyl－glass过量的角蛋白酶与活化的玻璃球反应，大约每1g玻璃球可固定100μg酶。固定酶的检验反应体系：0.2ml固定化的酶，1.2g羽毛角蛋白或酪蛋白，12mlpH7.5的0.05M磷酸盐缓冲液。每15min取一次反应液进行检测。固定结果固定化酶可以水解羽毛角蛋白和酪蛋白固定化酶的热稳定性检验方法0.1ml固定化酶或游离酶80、90℃处理不同时间，冷却到50℃后与1.9ml酪蛋白溶液混合后，50℃反应30min。离心后测定上清夜的A280检验结果固定化酶有更高的热稳定性固定化酶稳定性检测方法游离酶10μ或固定酶0.2ml，酪蛋白0.5gpH7.5的磷酸缓冲液50ml，加入0.02％的NaN3抑制微生物生长，50℃保温，每24h取样一次。检测结果7天后固定酶仍保持40％的活性，游离酶在2天后完全失活，可能是因为自身水解或变性。低pH值处理游离的角蛋白酶，2μg游离酶溶于5μl双蒸水，加到45μl不同pH缓冲液中，室温处理30min，加入到0.45mlpH7.5的磷酸钾缓冲液。再加入1.5ml酪蛋白溶液进行水解试验固定化酶在不同pH的缓冲液中浸泡30min，用1mlpH7.5的磷酸缓冲液冲洗后重溶于0.5ml磷酸钾缓冲液并进行酪蛋白水解试验。高pH值处理及不同pH处理结果将游离酶或固定酶加入到0.01MNaOH溶液中，处理30min后，用HCl溶液中和。高pH值不降低两种形式角蛋白酶的活性，但低pH可以降低两者的活性下午好