NaCl胁迫对滨海植物肾叶打碗花种子萌发的影响

NaCl胁迫对滨海植物肾叶打碗花种子萌发的影响引言目前，滨海沙地的植物逐渐由于种种原因比如旅游开发，人为开采等原因极大减少，使海滨的防风固沙能力减弱。因此海滨沙地植物应该逐渐受人类重视。关于NaCl胁迫的研究的报道比较深入，叶梅荣等研究了NaCl对吸胀后小麦种子发芽的影响[1],陈火英等研究了NaCl胁迫对不同品种番茄种子发芽特性的影响等[3],叶武威等探讨了NaCl和食用盐对棉花种子萌发的影响[2]，均得出高浓度的盐胁迫对种子萌发有显著的抑制作用。但是，这些主要针对的是农作物进行的耐盐性研究，对于滨海沙地的植物种子发芽的耐盐性研究的较少，本实验是研究不同NaCl浓度对肾叶打碗花种子萌发的影响，选择一些饱满的种子，用不同浓度的盐溶液对种子进行处理，观察肾叶打碗花种子的萌发情况，并用已处理的种子进行接下来的生理生化指标的测量。在NaCl的胁迫下，对种子的MDA,脯氨酸，SOD,POD,过氧化氢酶进行分析，探讨肾叶打碗花种子在不同盐分浓度下的耐盐性，为更好的选育肾叶打碗花种子打下坚实的基础，同时也能够更好的了解滨海沙地植物肾叶打碗花在滨海沙地的生长状况，并对其进行保护。也为后续对滨海植物的耐盐性的研究提供一定的理论基础。2.1材料与方法2.1.1实验材料实验以滨海植物肾叶打碗花种子为材料，肾叶打碗花种子于2012年9月采于浙江省舟山市桃花岛塔湾金沙，该植物具有重要的防风固沙的能力，此外也具有观赏价值及药用价值。选取大小一致，籽粒饱满，质地均匀的种子用于实验。2.1.2材料处理将选取的籽粒饱满，质地均匀的种子，先用浓硫酸溶液浸泡15min,再用清水冲洗干净，然后用3％的次氯酸钠消毒10min,最后用无菌水清洗3次，备用。将处理过的种子置于铺有3层滤纸的无菌培养皿内，分别用含浓度梯度0、25、50、100、150、200mmol/L的1/4Hoagland营养液培养，记录加入时间，在光照培养箱中进行种子萌发实验。培养条件为：温度28℃（白天）/25℃（夜晚），光周期12h/12h。每个处理3个重复。种子萌发过程中每隔24h观测记录种子萌发情况，以胚根露出种皮0.2cm长作为种子萌发的标志，每天上午9点记录发芽粒数，并将培养皿称重后补充蒸发的水分，使盐浓度基本保持一致。种子发芽是以芽长相当于种子一般长以上作为发芽标准。每天统计一次发芽数，发芽期至第7d结束。2.1.3测定内容与方法2.1.3.1肾叶打碗花种子萌发率，幼根和幼芽长度的测定在2012年10月16日，对肾叶打碗花的种子进行盐胁迫处理，之后每天对种子进行观察，并记录种子的发芽数，因第一天（10月17号）没有种子发芽，所以种子的发芽数从第二天（10月18号）开始记录。在对种子盐胁迫处理7天之后，对种子的幼根和幼芽长度用游标卡尺进行测量。2.1.3.2肾叶打碗花种子丙二醛（MDA）含量测定各个处理的种子在处理第7天后测量丙二醛的含量。重复三次。丙二醛(MDA)含量测定用硫代巴比妥酸(TBA)方法测定参照现代植物生理学实验指南(1999)的方法[8]。取0.2肾叶打碗花种子幼苗用液氮研磨后，加入10%三氯乙酸(TCA)6ml提取，于4000r/min离心10min，吸取离心的上清夜2ml(对照加2ml蒸馏水)，加入2ml0.6%硫代巴比妥酸(TBA，用10%TCA配制)溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。测定OD450、OD532和OD600值，根据双组分分光度计法计算MDA含量。用下列公式计算MDA浓度，C2为MDA浓度，C2(μmol/L)=6.45(D532一D600)一0.56D450。再根据叶片重量计算出MDA含量，单位以μmolg-1FW表示。2.1.3.3肾叶打碗花种子脯氨酸（Pro）含量测定各个处理的种子在处理第7天后测量脯氨酸的含量。重复三次。脯氨酸的含量测定采用酸性茚三酮法参照现代植物生理学实验指南(1999)的方法[8]，在建立脯氨酸含量的标准曲线后，测定盐胁迫下幼苗中脯氨酸的含量。称取0.2g幼苗用液氮研磨，加入5ml3%磺基水杨酸提取。于沸水浴中浸提10min，冷却后，3000r/min4℃离心10min，取上清液2ml，加入2ml3%水杨酸，再加入2ml冰乙酸和4ml2.5%酸性茚三酮，然后置于沸水于中显色60min。冷却后，加入4ml甲苯萃取红色物质。静置后，取甲苯相测定OD520值，对照标准曲线查出脯氨酸含量。在0.6一20μg/ml脯氨酸浓度范围为制作标准曲线，取标准液各2ml，显色、萃取、比色程序同上。脯氨酸含量用μg/g•FW表示。2.1.3.4肾叶打碗花种子抗氧化酶含量测定各个处理的种子在处理第7天后测量抗氧化酶SOD、POD、和CAT的含量。SOD活性测定采用氮蓝四唑(NBT)法[8]，取0.2g幼苗用液氮研磨后加入5ml50mmolPH7.8磷酸缓冲液提取，于12000r/min4℃离心20min。在盛有3ml反应混合液(在54mll4.5mmol/L的甲硫氨酸中分别加入均以50mmol/LpH7.8磷酸缓冲液配制的3μmol/LEDTA，2.25mmol/LNBT和60μmol/L核黄素各2ml)的试管中，加入0.05ml酶液混匀后放在透明试管架上，在光照强度为40μmolm-2s-1培养箱内25℃下照光8min，取出试管迅速测定OD560值，以不加酶液的照光管为对照。用下列公式计算酶的活性:酶单位群品量=反应被抑制(50%)×3ml反应混合液中加入的样品量。酶活性用U/g·FW表示。POD活性采用愈创木酚法测定[8],酶液制备同SOD酶，取适量酶液(磷酸缓冲液做空白对照)加入3ml反应混合液(l00mmol/LpH7.0磷酸缓冲液，20mmol/L愈创木酚);混匀后于25℃保温5min，加入20μlH202启动反应，测定OD470值。酶活性以U/g•Fw表示。CAT活性采用紫外分光光度比色法[8]，按照上述的实验操作提取酶液，但在研磨过程中需要加入少量石英砂和氯化钙。取样品测定管和对照管，分别在每支试管中加入PH=7.0的磷酸缓冲液1.0ml，蒸馏水1.7ml，酶提取液0.1ml，其中对照管的酶液要煮死。将上述管于25℃水浴中预热3min后，逐管加入0.2ml0.2mol／L过氧化氢溶液，加完后即可放入比色皿中在240nm下测量OD值。酶活性以U/g•min•Fw表示。每个指标均重复3次。2.1.4数据处理所有的数据用MicrosoftExcel2003输入和作图,并用SPSS17.0软件对数据用One-wayANOVA单因素方差进行分析,同时采用Duncan法对平均值进行多重比较。所有的数据均为三次实验的平均值±标准差，并在0.05水平进行显著性分析。2.2结果与分析2.2.1NaCl胁迫对肾叶打碗花种子发芽率的影响由上述图表可知：在NaCl浓度为0mmol/l到100mmol/l这一区间时，肾叶打碗花的种子都具有较高的萌发率，平均的发芽率均为80%以上。在NaCl浓度为25mmol/L时，其发芽率最接近对照组且略高于对照组，在NaCl浓度大于100mmol/L时，肾叶打碗花的发芽率显著降低，且随着盐溶液浓度的增加，种子的发芽率逐渐下降，且低于50％。在200mmol/L时其发芽率最低，只有11.67％。说明肾叶打碗花可以在低盐度下萌发，具有一定的抗盐能力，盐的浓度越高对种子的危害程度越大，抑制种子萌发。02040608010012002550100150200NaCl浓度（mmol/L）发芽率（％）图2-2-1不同NaCl浓度下肾叶打碗花种子发芽率2.2.2NaCl胁迫对肾叶打碗花种子根长和幼芽的影响由上述图表可以看出，肾叶打碗花种子萌发的幼根长随着NaCl浓度的升高呈现先升高后下降的趋势，在盐浓度为25mmol/L时，幼根长最长，且与对照组相近，在NaCl浓度为100mmol/L时，幼根长显著下降，在盐浓度为200mmol/L时，幼根长最短，说明高盐度能够抑制幼跟的生长，而低浓度则可略微促进幼根的生长。观察肾叶打碗花幼根的生长发育情况可知，盐溶液浓度越高，长出的幼根又短又粗。由结果可以看出，肾叶打碗花种子萌发的幼芽长也随着盐浓度的升高呈现先升高后下降的趋势，其变化趋势基本上与幼根长的变化是一致的。在NaCl浓度为100mmol/L时，幼根芽显著下降，在NaCl浓度为200mmol/L时，幼芽长最短。图2-2-2不同NaCl浓度下肾叶打碗花幼根长(A)和幼芽长(B)2.2.3NaCl胁迫对肾叶打碗花种子丙二醛的影响一般来说，在逆境胁迫下，会导致植物体中丙二醛含量的变化，由上述图表可知：随着NaCl溶液浓度的增高，肾叶打碗花种子的丙二醛好含量呈先逐步升高然后下降的趋势，图中看出在盐溶液浓度为150mmol/l时，丙二醛含量最高，NaCl溶液浓度为25mmol/L时，丙二醛含量最低，与对照组值比较接近，在NaCl溶液浓度为100mmol/L时，丙二醛含量上升显著（P＜0.05）。但是在NaCl溶液浓度为200mmol/L时，丙二醛含量下降，但仍高于对照组。丙二醛是植物在逆境胁迫下膜脂过氧化之后的产物，会严重损伤生物膜。因此丙二醛含量越高，植物受盐胁迫侵害越严重。通过结果说明在NaCl溶液浓度为100mmol/L时肾叶打碗花的种子生物膜受到损伤，随着盐胁迫的加重，这种损伤也越来越严重。01234502550100150200NaCl浓度（mmol/L）幼根长（cm）A00.511.522.5302550100150200NaCl浓度（mmol/L）幼芽长（cm）B图2-2-3不同NaCl浓度下肾叶打碗花种子萌发后幼苗丙二醛(A)和脯氨酸(B)含量2.2.4NaCl胁迫对肾叶打碗花种子脯氨酸的影响在逆境条件下，植物体内脯氨酸的含量显著增加。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往在体内积累较多的脯氨酸。在一定程度上，脯氨酸含量可以作为植物抗性的指标。由上述图表可知：在NaCl溶液浓度为25mmol/L时，脯氨酸含量变化不大，之后随着盐溶液浓度的增加，脯氨酸含量显著上升（P＜0.05）。在NaCl溶液浓度为100mmol/L时，达到最高值，超过150mmol/L时脯氨酸含量开始下降，仍然显著高于对照组（P＜0.05）。说明在一定的浓度内肾叶打碗花种子萌发后可以积累较多的脯氨酸应对盐胁迫，表现出较强的耐盐性。2.2.5NaCl胁迫对肾叶打碗花种子抗氧化酶的影响2.2.5.1NaCl胁迫对肾叶打碗花种子SOD的影响由实验结果可知：肾叶打碗花的超氧化物歧化酶活性随着NaCl溶液浓度的增高而呈现略微下降的趋势，在NaCl溶液浓度为25-100mmol/L时，超氧化物歧化酶活性基本没有变化，在NaCl浓度为150mmol/L和200mmol/L时，超氧化物歧化酶活性显著下降（P＜0.05）。结果说明在轻度盐胁迫下，肾叶打碗花种子萌发的过程中，超氧化物歧化酶起不到保护作用，随着盐浓度的增加，这种酶的保护能力大大降低。2.2.5.2NaCl胁迫对肾叶打碗花种子POD的影响由上述图表可知：随着NaCl溶液浓度的增高，过氧化物酶（POD）活性呈现先升高后下降的趋势，但是活性升高并不明显，而且不规律，可认为其值和对照组相近，没有太大变化，而在NaCl浓度为150mmol/L和200mmol/L时，过氧化物酶活性显著下降（P＜0.05）。说明在肾叶打碗花种子萌发过程中，过氧化物酶也没有起到很好的保护作用，活性没有被激发，而随着盐浓度的升高，这种保护能力极大降低。00.050.10.150.20.250.30.3502550100150200NaCl浓度（mmol/L）丙二醛含量（μmol/L）A0246810121402550100150200NaCl浓度（mmol/L）脯氨酸（μg/g）B图2-2-4不同NaCl浓度下肾叶打碗花种子萌发后幼苗SOD(A)、POD(B)和CAT(C)的影响2.2.5.3NaCl胁迫对肾叶打碗花种子CAT的影响过氧化氢酶是生物体内的一种抗氧化剂，催化细胞内过氧化氢发生