PCR常见问题及解决方案

问题可能原因解决方法无产物或产量低模板浓度偏低或偏高电泳检测模板浓度，调整模板用量模板降解重新制备；基因组DNA、cDNA应小量分装后低温保存模板中含有抑制反应的杂质纯化模板引物浓度不足调整引物浓度，特别是针对长片段PCR引物存在二级结构重新设计引物，避免二级结构；优化退火温度引物降解引物应高浓度小量分装，-20℃保存，避免反复冻融Mg2+浓度偏低适当提高Mg2+浓度，从1mM到3mM以0.5mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP降解-20℃保存，小量分装，避免反复冻融酶纯度低，扩增效率差选用高质量DNA聚合酶酶量不足适当增加酶量用酶不当针对模板、目标片段的特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)缓冲液失效更换缓冲液或使用预混PCR反应体系模板变性不充分适当延长变性时间；对高GC或复杂结构模板，提高起始变性温度至98℃退火温度偏高降低退火温度，应比引物Tm低至少5℃延伸时间不足增加延伸时间，特别是针对长片段PCR循环数目不够增加循环数PCR管污染质量可靠的PCR管通常不需灭菌，否则应先高温高压灭菌处理；用过的PCR管不可清洗后重复使用PCR仪故障检查程序和模块温度其他使用PCR增强剂非特异产物过多体系污染设计对照实验寻找污染源，操作时应注意避免交叉污染引物浓度过高适当减少引物浓度引物序列特异性差重新设计引物Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度，从1mM到3mM以0.5mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度dNTP浓度过高降低dNTP浓度酶量过多减少酶量，以0.5U间隔递减退火温度过低提高退火温度延伸时间过短增加延伸时间，以1min间隔递增循环次数过多减少循环次数模板结构过于复杂或目标片段过长特选择适当的酶(详见PCR产品选择指南)；使用PCR增强剂其他HotStartPCRTouchDownPCR巢式PCR引物引物3’末端存在互补序列重新设计引物引物浓度过高降低引物浓度PCR常见问题及解决方案二聚体模板浓度过低提高模板浓度退火温度不合适优化退火温度循环次数过多减少循环次数其他HotStartPCR拖尾严重引物浓度过高调整引物浓度引物序列特异性差或模板上存在同源序列重新设计引物模板降解重新制备模板模板浓度过高降低模板浓度dNTP浓度过高减少dNTP用量Mg2+浓度过高降低Mg2+浓度，从1mM到3mM以0.5mM间隔递增，针对不同模板和引物摸索最佳Mg2+浓度酶量过多或质量差减少酶量，以0.5U间隔递减；更换质量可靠的酶变性温度过低提高变性温度，以0.5℃递增退火温度过低提高退火温度延伸时间过长缩短延伸时间循环次数过多减少循环次数，以2个循环间隔递减体系污染设计对照实验，消除污染源其他HotStartPCRTouchDownPCR巢式PCR假阳性目标片段与非特异扩增片段间存在同源性设计阴性对照，确认为引物问题后重新设计引物体系污染设计阴性对照判断是否有污染，去除污染源