PCR在HIV感染研究中的应用

PCR在HIV感染研究中的应用前言简介HIV与PCR技术主体内容一、HIV的基因结构二、PCR在鉴定HIV感染中的意义三、HIV感染的定量PCR研究四、PCR的相关问题五、实例结语前言八十年代以来由人类免疫缺陷病毒HIV（HumanImmunodeficiencyVirus)感染而引起的艾滋病（AIDS）因其严重的危害性而受到人们高度重视。图一：HIV图二：HIV力争早期诊断和寻求有效治疗是防止其广泛传播的关键所在。聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)1985年，Mallis等根据核酸自然扩增理论，建立了一种人工体外DNA扩增技术，即聚合酶链式反应，并于1987年完成了自动化操作，极大地推动了分子生物学的发展，也为包括病毒感染在内的临床疾病诊断提供了一种崭新的手段。1、PCR的基本原理靶DNA分子变性后解链，两条单链DNA分别经复性与两条引物互补结合，在4种dNTP存在和合适的条件下，由DNA聚合酶催化引物由5’－3’扩增延长，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA增加1倍，新合成的DNA链又可作为下一个循环的模板，经过30～50个循环，可使原DNA量增加106～109倍。2、主要步骤PCR的每一循环包括变性、复性、延伸3个步骤，此外整个试验应包括DNA模板提取，如果模板为RNA，还需增加从RNA到DNA的逆转录过程。除模板提取外，这些操作均可在同一系统中完成，仅仅改变反应温度即可完成。3、引物的设计4、常用的PCR技术（定量PCR等）5、PCR产物的分析（凝胶电泳等方法）PCR具有敏感、特异和快速的特点，是检测艾滋病病毒、评价病情进展和探讨发病机理的有效工具。本文将就目前HIV与PCR研究的现状，谈谈PCR技术在HIV研究中的应用。一、HIV的基因结构HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA双分子，其单链RNA分子由9749个核苷酸组成，有3组共9个基因。HIV的模式图第一组为逆转录病毒共同的基因：gag、pol、env基因，及侧翼的长末端重复顺序（LTR）等。第二组为调节基因表达的基因：tat、rev、nef。第三组为特有基因：vif、vpu、vprHIV基因组的蛋白产物HIV有十分高的遗传变异率，是一个多态性病毒。高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段，gag和pol基因较少变异。目前已知HIV有两个型：HIV-1和HIV-2。因此，只有选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因加以扩增，才能有效地检测所有HIV的变异性。二、PCR在鉴定HIV感染中的意义HIV常可引起潜伏感染，但仍具有传染性，整合的病毒基因组在每个细胞中仅以很低的DNA拷贝数存在，因此，需要建立一个敏感而又特异的HIV检测方法。传统的HIV检测方法病毒体外培养法逆转录酶法外周血液中核衣壳抗原直接检测法原位杂交法Southern印迹法等等缺点：比较费时费力，稳定性、特异性、敏感性较低。PCR方法的优点：三、HIV感染的定量PCR研究对体内的病毒水平作准确的定量分析，有助于对感染过程的各期作病因性分析，观察药物的疗效，更好地指导治疗。目前检测体内HIV活性的方法有限，虽然循环血CD4+细胞计数、血清P24抗原、新喋呤等曾用来指示HIV感染时病毒的水平，其敏感性和特异性均受限，定量培养又费时昂贵。定量PCR是HIV感染中直接测定病毒本身的最佳途径。定量PCR旨在评估样本中靶基因的分子数。用PCR对靶基因定量，是根据一定循环次数后，PCR产物的量来推断样品中原始模板的量。但由于目前技术上的原因，很难获得样品中某一基因的绝对数量，而往往是通过设置内参标或外参标来作相对的定量。其中外参标法中主要有PCR产物的直接定量法，极限稀释法；内参标法中主要有同步扩增法和竞争性PCR等。四、PCR的相关问题1、模板的选择和提取目前作为诊断和研究的标本多采用外周血，此外也可在脑脊液、表皮组织、唾液和精液中来提取模板。多采用粗制细胞裂解液或冰冻血液直接进行扩增。2.选择合适的引物引物设计的原则：选择缺乏二级结构的保守区。gag,tat,env,pol引物长度18-30个核苷酸。引物不能与其它嗜人淋巴细胞病毒和人细胞DNA同源。可设计“套式”引物。在用于临床标本前，要鉴定引物特异性。3.扩增产物的检测和分析可采用凝胶电泳法，限制性内切酶法，测序法及分子杂交分析法。凝胶电泳法可初步判断PCR产物的特异性，限制性酶切法可进一步表明产物的特异性，而核苷酸测序技术则是检测PCR产物特异性的最可靠办法。分子杂交分析既是检测产物特异性的一个好方法，又是检测扩增产物上碱基突变的有效方法。五、实例PCR-mediatedrecombination:Ageneralmethodappliedtoconstructchimeric（嵌合）infectiousmolecularclonesofplasma-derivedHIV–1RNATostudypathogenesis（发病机理）anddevelopvaccines（疫苗）,itwouldbedesirabletouseinfectiousHIVclonesderivedfromplasmaviralRNA,whichismorerepresentativeofthereplicatingviruspoolthanproviralDNA.Themethoddescribedheremakesconstructionofsuchclonespossible.It’sawidelyapplicable,improvedmethodtoconstructrecombinantDNAmoleculeswithoutrelianceonrestrictionsitesandalsodiffersfromolderPCR–mediatedrecombinationproceduresinseveralways．1.ConstructionofchimericHIV–1clonesToconstructfull–lengthinfectiousclonesofHIV–1,wefirstusedamethodwehadpreviouslydevelopedtoclonecompleteHIV–1genomesdirectlyfromplasmaviralRNAusinglongreversetranscriptionandPCR(RT–PCR).LongcDNAswerederivedfromthe3'and5'halvesoftheHIV–1RNAgenome.Then,two5–kbDNAfragmentscontainingthe5'and3'half–genomeswerejoined.Problem:thesequenceofthevirusthatappearsintheRNAformdiffersinthelongterminalrepeat(LTR)regionfromthatfoundintheDNAorproviralform.Forthisreason,theHIV–1genomeclonedfromvirion–associatedRNAhasincompleteLTRs;itneedstohavecompleteLTRsattachedforclonestobeinfectiousasDNA.Therefore,DNAfragmentsfromproviral5'and3’LTRregionswerelinkedtothe5'and3’endsoftheconstructs,respectively.DNAfragmentswereobtainedfromtwosourcesintheexperimentsdescribedhere:ClonedcDNAreverse–transcribedfromplasmaviralRNA(plasmidsFG901–18andFG902–12)andclonedproviralLTRDNA(plasmidpNL4–3,whichcontainsafull–lengthHIV–1proviralgenome1).Fig.1SchematicdiagramofthePCR-mediatedrecombinationstrategyusedinconstructingHIV-1chimericinfectiousclones.The10–kb,PCR–amplifiedfragmentwasdetectedbygelelectrophoresisasachiefband.Thefull–lengthproductwasthenisolatedanddirectlyclonedintoaTAvector.ThestructureofthechimericDNAproductwasverifiedbyrestrictiondigestionpatternsandpartialDNAsequencing.2.SequencefidelityofclonesTodeterminethesequencefidelity（保真性）offull–lengthclonesconstructedbyPCR–mediatedrecombination,twooftheconstructedfull–lengthinfectiousclones(clonesFG9012–38andFG9012–40)andtheirparentalplasmidswereentirelysequenced.Onlyonemutationwasfoundinclone38andnonewasfoundinclone40.ThePCR–introducederrorwasatransition(AtoG),andwaslocatedintheuntranslatedregion.Noothermutationsincludingframeshifts,deletions,orinsertionswerefound.3.InfectivityofconstructedclonesThefull–lengthchimericmoleculesconstructedfromplasma–derivedHIV–1RNAandproviralDNA–derivedLTRsweretestedforinfectivitybytransfectionintohumandermalfibroblastcells（成纤维细胞）.ControlsincludedthetransfectionofpNL4–3plasmidDNAandtheTAvectorplasmidDNA.Approximatelyhalfoftheconstructedclonestested(5of9clones)producedvirusparticles,asdeterminedbybothHIV–1p24antigenandreversetranscriptaseassays.Theseparticleswereconfirmedtobeinfectiousvirus.NoviruswasdetectedfromthecontrolexperimentsusingonlyvectorplasmidDNA.4.EfficiencyofconstructionInthissystem,theefficiencyofPCRdependsonthelengthoftheoverlapsequenceandtheconcentrationofmegaprimers.Longeroverlapsresultedinahigheryieldoffull–lengthmolecules.Theyieldoffinalproductswasgreatlyimprovedbyusingahighco