PRO-542体外阻断CD4细胞HIV感染的研究

免疫学实验设计题目PRO-542体外阻断CD4细胞HIV感染的研究班级08级临床医学本科一班姓名丁佩毅5108001028魏巍5108001041吴涛5108001044杨依航5108001046田宜平51080260141研究背景AIDS是因HIV侵入机体，引起细胞免疫严重缺陷，导致以机会性感染、恶性肿瘤和神经系统病变为特征的临床综合症。自1981年发现首例艾滋病例以来，AIDS在全球广泛蔓延。根据联合国艾滋病规划与世界卫生组织联合发布的报告，2009年全球共有3330万艾滋病感染者；我国自1985年发现第一例艾滋病以来，截至2009年底，现有艾滋病病毒感染者和病人约74万。HIV属转录病毒，根据血清反应和病毒核酸序列可分为两型：HIV-1型和HIV-2型。HIV-1型广泛分布于世界各地，是引起全球艾滋病（HIDS）流行的主要病原。临床上目前常用的抗HIV药物主要有以下两类：（1）核苷类和非核苷类逆转录酶抑制剂：此类药物的作用机制是干扰HIV的DNA合成。（2）蛋白酶抑制剂：其作用机制是抑制HIV蛋白酶水解，使病毒的大分子聚合蛋白不被裂解而影响病毒成熟与装配[1]。近年来,以封闭gp120和CD4的结合位点,阻断CD4受体与gp120的接触为靶点,研制出一系列新型HIV-1抑制剂，主要有CD4的类似物、可溶性的CD4、毒素与CD4的共扼物、CD4或gp120的特异的单克隆抗体和一些化学小分子。gp120与CD4结合抑制剂还包括右旋糖苷硫酸盐，resobene,IgG2-CD4融合蛋白异四聚体PRO-542以及FP21399(一种双偶氮染料)等。PRO-542是一种由CD4的D1~D2区和HIV一种天然抗体IgG2的保守区融合而成的重组蛋白，其含有4个IgG2分子,轻链的可变区被CD4分子的D1/D2取代。PRO-542含有4个gp120的结合位点，因此，比可溶性的CD4蛋白有更好的抗HIV活性和机体耐受性,目前正处于Ⅰ/Ⅱ期临床试验阶段[2-3]。2研究目的探究病毒吸附抑制剂PRO-542对细胞感染HIV的拮抗作用。3实验原理HIV主要侵犯宿主的CD4+T细胞以及CD4分子的单核/巨噬细胞、树突状细胞和神经胶质细胞等。HIV通过其囊膜的gp120与靶细胞膜表面CD4分子结合，导致gp120构想改变，暴露出被其掩盖的gp41，gp120-CD40结合CCR5,gp41的N末端嵌入细胞膜，病毒包膜与细胞膜发生融合，病毒核心进入靶细胞。病毒吸附抑制剂PRO-542可以通过结合HIV-1表面的gp120，使gp120失活，干扰毒粒吸附到靶细胞，阻断HIV-1侵入免疫细胞。本次实验利用Ficoll离心法分离提取HIV-1志愿者的PBMC，并从艾滋病患者血清中离心分离出HIV-1病毒，将病毒和不同稀释度的抗体结合并设置对照组进行培养，通过p24ELISA检测上清病毒载量，反应病毒的感染情况。4实验材料PR0-542、HIV-1志愿者全血、RPMI-1640培养基(100U青霉素，100µg链霉素，5µg/mlIL—2和10%热灭活胎牛血清)、HIV-1病毒培养液、培养箱、液氮、细胞培养板、HIV-1p24抗原检测试剂5实验方法5.1HIV-1-志愿者PBMC的分离人外周单个核细胞分离自HIV-1-志愿者，采取全血后用Ficoll离心法分离PBMC，培养基为RPMI—1640。所有细胞培养在37℃、5%二氧化碳培养箱。5.2培养和分离HIV-1病毒无菌从3名艾滋病患者抽取5ml全血，分离血清后混合，在p2实验室中，上述制备PBMC暴露于纯粹病毒2h后，添加培养液使细胞浓度为5×104个/毫升。每2天换1次培养液，7天后，收集上清1000g离心去除细胞。检测TCID50后将含病毒上清分装于液氮保存。5.3病毒中和实验病毒中和实验使用上述制备PBMC。方法如下：先把500TCID50（50%的病毒组织感染量）病毒和不同稀释度（1:1、1:4、1:16、1:64、1:256、1:1024、1:4096）的抗体等量混合后37℃预孵育60min，加入到含5×104cells/well的培养板中，同时做未加抗体组做为对照，每组做3孔。37℃孵育过夜，洗去未结合的病毒和抗体，37℃5%二氧化碳培养箱培养，每2天换液1次，去除上清，加入新鲜培养基。10d后收集培养上清，使用p24ELISA检测培养上清病毒载量。重复做3次独立的实验。含病毒操作均在p3实验室进行。5.4p24ELISA检测培养上清病毒载量培养上清HIV病毒RNA载量使用p24ELISA进行检测。抑制率%=[1-(阻断组p24)/(对照组p24)]×100%。附：技术路线6预测结果赵磊等[4]对抗HIV-1gp120单克隆抗体病毒中和实验所得的抑制率如下图：由此推断，随着PRO-542浓度的增加，PRO-542对HIV-1的抑制程度增加。HIV-1-志愿者PBMC的分离培养和分离HIV-1病毒病毒中和实验p24ELISA检测培养上清病毒载量7讨论PRO-542是一种由CD4的D1~D2区和HIV一种天然抗体IgG2的保守区融合而成的重组蛋白，其含有4个IgG2分子,轻链的可变区被CD4分子的D1/D2取代。PRO-542含有4个gp120的结合位点，特异性的与gp120结合，使gp120失活，干扰毒粒吸附到靶细胞，阻断病毒入侵[5-6]。PRO-542不仅可以在吸附结合融合进入靶细胞的每一个环节发生作用，同时也可以阻止组装的核衣壳和胞饮病毒的释放，从而中和病毒活性，抑制病毒复制。与单克隆抗体类似，PRO-542的中和活性与其浓度的高低成正相关，浓度高时，PRO-542能够很大程度上抑制HIV感染，随着浓度的降低病毒表面结合的PRO-542减少，中和活性降低，抑制率下降。ｐ24是HIV的主要核蛋白，参与形成病毒核心颗粒的外层，对形成HIV病毒颗粒是必不可少的。病毒RNA被包裹在核心颗粒中从而形成感染性颗粒，由于在病毒复制过程中p24和RNA有这种密切关系，因此从理论上讲，检测p24抗原的试剂可以作为RNA检测的一种替代方法。另外，在病毒复制过程中，一个成熟的病毒粒子可以产生具有1500拷贝的HIV的p24抗原，它是病毒复制过程中产生的含量最多的蛋白质，并且可以存在较长时间，这些特性有助于其作为靶蛋白用于HIV的抗原检测。检测p24抗原时直接检测病毒组分蛋白，具有高度特异性，因此可以最直接反应病毒的感染，使本实验结果的检测更加准确、可靠[7]。参考文献[1]金伯泉.医学免疫学[M].第5版,北京:人民卫生出版社,2008:204-208.[2]吴钦梅.HIV21进入细胞机制及进入抑制剂的研究进展[J].中国病原生物学杂志,2006；1（3）:229-231.[3]于晓琳,杨铭.HIV进入宿主细胞的分子机制及相关药物研究进展[J].中国新药杂志,2004;13(12):1084-1089.[4]赵磊等.抗HIV-1gp120单克隆抗体体外阻断CD4细胞HIV感染的研究[J].陕西医学杂志,2010;39(7):797-801.[5]PingZhu,etal.StructuralFlexibilityandFunctionalValenceofCD4-IgG2(PRO542):PotentialforCross-LinkingHumanImmunodeficiencyVirusType1EnvelopeSpikes[J].JOURNALOFVIROLOGY,2001;75(14):6682-6686.[6]JeffreyM.Jacobson,etal.TreatmentofAdvancedHumanImmunodeficiencyVirusType1DiseasewiththeViralEntryInhibitorPRO542[J].ANTIMICROBIALAGENTSANDCHEMOTHERAPY,2004;48(2):423-429.[7]王佑春.艾滋病实验室检测技术与质量保证[M].北京:科学出版社,2009:81.