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microRNA的引物设计以ssc-miR-222-3p为例设计引物,其成熟体序列为:AGCTACATCTGGCTACTGGGTCT反向引物:每个反向引物的都带有一段固定的序列,可以形成一个茎环,固定的序列为:5,-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3,在这个序列后加上八个碱基,这八个碱基是ssc-miR-222-3p从后面数八个碱基的反向互补序列,就是CTGGGTCT的反向互补:AGACCCAG,最后得到的反向引物的序列为5,-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGACCCAG-3,正向引物:每个正向引物也带有一段固定的序列,固定的序列为:ACACTCCAGCTGGG在这个序列后加上于成熟体除后面六个外剩下的碱基序列,成熟体除掉后面六个碱基后序列为:AGCTACATCTGGCTACT5,-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATCTGGCTACT-3,URP:统一反向引物,也是一段固定的序列,TGGTGTCGTGGAGTCGU6引物F-CTCGCTTCGGCAGCACA,R-AACGCTTCACGAATTTGCGT使用方法:1逆转的引物:所有要做的miRNA反向引物的混合,每个10微升2PCR的引物:50微升的体系,30微升的水,10微升的正向引物,10微升的URP2.hsa-miR-124(hsmq-0032引物)推荐退火温度:60℃hsa-miR-124扩增曲线示意图hsa-miR-124融解曲线示意图3.hsa-miR-125b(hsmq-0034引物)推荐退火温度:60℃hsa-miR-125b扩增曲线示意图hsa-miR-125b融解曲线示意图4.hsa-miR-137(hsmq-0035引物)推荐退火温度:60℃hsa-miR-137扩增曲线示意图hsa-miR-137融解曲线示意图5.hsnRNAU6引物测试推荐退火温度:60℃hsnRNAU6扩增曲线示意图hsnRNAU6融解曲线示意图6.电泳结果取5μlPCR产物进行电泳,胶浓度(3%),所有检测都为两个阳性,一个NTC其中泳道1为hsa-miR-16、泳道2为hsa-miR-124、泳道3为hsa-miR-125b、泳道4为hsa-miR-137、泳道5为hsnRNA-U6[img]
本文标题:microRNA反转和定量引物设计原理实验方法
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