MTT-PC3

MTT法测细胞存活率一.实验对象：PC3细胞（前列腺癌细胞）二.实验目的：用不同浓度梯度的硫丹溶液对PC3细胞进行不同时间的暴露处理，以确定该细胞存活率是否存在剂量和时间依赖性。三.实验原理：活细胞的线粒体中存在与NADP相关的脱氢酶，可将黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色甲瓒，死细胞此酶消失，MTT不被还原。用DMSO溶解甲瓒后可用酶标仪在550nm波长处检测光密度，可间接反映活细胞数量。四.实验材料及仪器：二甲基亚砜（DMSO），硫丹，F-12K培养液，MTT试剂盒（凯基生物，南京），96孔板，酶标仪五.实验方法：（一）细胞培养PC3细胞培养在F-12K培养液中，于37°C，5%CO2条件下常规培养，两天一换液，四天一传代。（二）细胞铺盘PC3细胞分别接种于2个96孔板中，正常培养12h。具体步骤如下：1.实验前的准备：①提前30min打开超净台的紫外灯，并在37℃下预热PBS、培养液30min，Tripsin在室温下放置30min②所需器材：96孔板2个，50ml离心管2个，移液枪及相应移液枪头若干等③相关计算：96孔板每一行分别设置空白对照组、细胞组（Cell）、DMSO组、0.1uM、1uM、10uM、20uM、50uM、100uM、200uM硫丹梯度浓度组，共计10组，每组5个样本，共计50个样本，为了防止意外，我们按60个样本进行计算。根据之前的摸索，每孔加5000个细胞可以得到更好的试验效果。所以我们每板需细胞5000×60=3.0×105个，三板总计6×105个④根据需要提前将培养液（约20mL）分装至50mL离心管中。2.实验步骤：①从孵箱中取一盘正常培养2—3天的细胞，此时细胞融合度达到80%左右，对其进行细胞计数，并求出细胞密度C细胞；②根据①步求所需细胞悬液的体积V1=（6.0×105÷C细胞）uL，因为所需总体积V=100uL×60×2=1.2×104uL，所以所需添加的培养液体积V2=V-V1；③根据上述计算先后往50mL离心管中添加细胞悬液及培养液；④反复吹打100次左右，使细胞充分混匀；⑤用移液枪吸取100uL细胞悬液分别添加至96孔板中，其中空白对照组最后添加且只需添加培养液；⑥细胞接种结束后，放显微镜下观察铺盘是否均匀；⑦放孵箱中正常培养12h。3.注意事项：铺盘是否均匀直接影响到实验效果的好坏。因此为了得到更好的实验效果我们在铺盘时应注意：边接种细胞边吹匀离心管中的细胞悬液（每接种两孔反复吹打三次）；移液枪打出细胞悬液时不要太快以免细胞堆积在孔中央；铺盘结束后，左手扶孔板左侧，右手指轻轻敲击孔板右侧三下，之后顺时针旋转90°重复上述操作，共旋转三次；静止15min之后再放入孵箱进行正常培养。（三）硫丹暴露处理实验组硫丹浓度为0.1uM、1uM、10uM、20uM、50uM、100uM、200uM，对照组DMSO浓度为0.1%，暴露时间分别为24h和48h。具体实验步骤如下：1.实验前的准备①提前30min打开超净台的紫外灯，并在37℃下预热培养液30min，室温下放置纯DMSO及0.5M硫丹溶液②所需器材：1.5mL离心管及其管架，移液枪及相应移液枪头，15mL离心管，50mL离心管③相关计算：为了减少误差，要求0.5M硫丹溶液的取量至少为1uL，并且浓度由0.5M——500uM——100uM/200uM逐步稀释，最后再由100uM稀释成各浓度梯度。每组5个样本，每个样本100uL，则每板每组100uL/well×10well（实际做5well）。计算结果如下所示：表一100uM硫丹稀释至各浓度梯度终浓度稀释倍数100uM量(uL)F-12K量(uL)Total（uL）0.1uM1/1000199910001uM1/10010990100010uM1/10100900100020uM2/10200800100050uM5/105005001000100uM1100001000由表一可知：每板100uM硫丹用量为1811uL，两板总计2622uL。每板F-12K培养液用量总计为4189uL，两板总计8378uL。表二0.5M硫丹稀释至500uM终浓度稀释倍数0.5M量(uL)F-12K量(uL)Total（uL）500uM1/1000329973000表三500uM硫丹稀释至100mM/200uM终浓度稀释倍数500uM量(uL)F-12K量(uL)Total（uL）100uM1/5150050007500200uM2/5100015002500根据上述三表、空白对照组以及阴性对照DMSO组，可知所用F-12K共计约25mL，可提前分装至50mL离心管中。2.实验步骤①根据上述计算，分别用0.5M硫丹配制500uM硫丹、100uM硫丹及200uM硫丹，再配制成各浓度梯度的硫丹溶液，分装于6×2个1.5mL离心管中，充分混匀后待用；②取5mLF-12K培养液于15mL离心管中，再向其中添加5uL纯DMSO，往复吹打使其充分混匀，放于离心管架待用；③先取出一个96孔板，吸走孔板中一组悬液，再向该组各孔中添加对应浓度的硫丹溶液100uL，依次类推直至最后一组。用同样方法对另外一个96孔板进行操作；④放入孵箱，对两个96孔板分别正常培养24h、48h。3.注意事项①为了保证稀释浓度的精确性，一律用移液枪进行取液和混匀；②取1.5mL离心管时，不要用手直接去拿，要倒在超净台上，然后标记放在离心管架上；③稀释溶液时，要先加溶剂后加溶质，并尽量保证所有溶液都被打出；④当配置好各浓度梯度的硫丹溶液并放置于1.5mL离心管架上时，为了节约时间，可以用一只手遮住离心管盖，另一只手托住离心管架，上下颠倒数次使其混匀；⑤在吸取悬液时，为了节约时间、提高效率，我们可以使用以下方法：左手托起96孔板底部，使其倾斜30°左右。右手使用负压吸引器，将短的移液管一端插入黄色枪头，另一端连接软管。将黄色枪头对准每孔的最底部耐心的一个个用枪头吸，枪尖的力度和方向要保证每个孔都一致，保证在不吸走细胞的情况下尽量完全吸走悬液；⑥每吸走一组悬液就添加一组试剂。（四）MTT分析硫丹暴露时间结束后用MTT试剂盒（凯基生物，南京）依照操作说明测定细胞存活率，并计算细胞半数抑制浓度(IC50)。具体操作步骤如下：1.实验前的准备：①提前30min打开超净台的紫外灯，并把MTT试剂盒从4°冰箱中取出置于室温下，准备好DMSO；②所需器材：移液枪及相应移液枪头，平板摇床，酶标仪③相关计算：所需1×MTT量=50uL/Well×60Well×2=6000uL，所需DMSO量=150uL/Well×60Well×2=18000uL。计算结果如下表5×MTT稀释至1×MTT终浓度稀释倍数5×MTT量(uL)Buffer量(uL)Total（uL）1×MTT1/51800720090002.实验步骤①将5×MTT用DilutionBuffer稀释成1×MTT；②每孔加50μL1×MTT，在37℃孵育4小时，使MTT还原为甲瓒；③吸出上清液，每孔加150μLDMSO使甲瓒溶解，用平板摇床摇匀5~10min；④酶标仪在550nm波长处检测每孔的光密度（如无550nm波长，于490nm波长处检测亦可）。3.注意事项①始终保持96孔板平拿平放，防止孔内液体沾在孔板盖上；②加完MTT反应4h后，从培养箱取出96孔板的动作要轻柔，避免振荡结晶,使其滑落；③不要让枪头接触到孔底，且一旦倾斜孔板后就不要反复倾斜放平，这样也会使结晶脱落。六.实验结果：如下表所示MTT分析结果总览表nblankcellDMSO5102040608010010.0090.8230.8950.7280.6870.7280.6040.3480.2930.22920.0060.5170.7250.7880.8040.8030.4680.4760.5090.39530.0050.6530.6880.7000.7040.6560.6230.5060.3550.38140.0020.8480.6580.7910.5800.5310.6190.4160.2570.3925-0.0230.6020.7560.7850.6890.5830.4850.3030.3210.304avg-0.00020.68860.74440.75840.69280.66020.55980.40980.3470.3402std0.01300.14290.09190.04170.07940.10910.07660.08500.09740.0725（一）细胞存活率：将各测试孔的OD值减去本底OD值，各重复孔的OD值取均数±SD。细胞的存活率以T/C%表示，T为加药细胞的OD值，C为对照细胞的OD值。细胞存活率%=（加药细胞OD/对照细胞OD）×100不同硫丹浓度下的细胞存活率细胞存活率%CellDMSO51020406080100测试孔0.68880.74460.75860.6930.66040.560.410.34720.3404DMSO0.74460.74460.74460.74460.74460.74460.74460.74460.7446T/D*10092.51100.00101.8893.0788.6975.2155.0646.6345.72-0.100.10.20.30.40.50.60.70.80.9blankcellDMSO51020406080100OD值endosuifanMTT分析结果总览表（二）求出T/C=50%时的药物浓度（IC50）由上图可知IC50=71.88uM，重复实验，进行验证。七.分析与讨论（一）对上述实验结果作线形趋势图：由上图可知，随着硫丹浓度的增加，细胞的存活率逐渐降低，故证明细胞的存活率具有剂量依赖性。（二）实验的不足之处及原因分析1.不足之处：①同一组测试孔的数据误差较大；②细胞存活率并不是完全与硫丹浓度成反比，其中Cell组的细胞存活率低于调零组，实验组5uM的细胞存活率高于调零组，这些数据都不符合理论数值；2.原因分析：①用单个移液枪先后接种细胞或者细胞悬液没有充分混匀，导致各测试孔的细胞数量不能达到统一标准；②细胞铺盘不均匀，影响细胞生长和硫丹对细胞的杀伤作用；③在吸走孔板中的旧液时，由于力度不均一，导致每孔中会被吸走数量不等的细胞数；④实验操作少，仍没摸索出最佳点板浓度；⑤个人实验经验少，实验操作仍不熟练。51020406080100T/D*100101.8893.0788.6975.2155.0646.6345.72y=-0.526x+87.809020406080100120细胞存活率不同硫丹浓度下的细胞存活率T/D*100线性(T/D*100)IC50=71.88