NMR实验技术

核磁共振实验技术核磁共振（NuclearMagneticResonance）技术（方法）是从原子水平研究物质结构的强有力手段，在生物、医学、药物、料、环保、化工以及地矿等各个领域发挥着重大的作用。到目前为止，NMR技术已是鉴别化合物结构最重要，也是最准确的方法之一。NMR技术也是唯一能够获取生物大分了溶液构象的方法。因此，NMR谱仪对基础科学和应用基础科学等重点领域中的重大研究项目都具有极其重要的意义。目前我国核磁谱仪有800多台，每年还以60-80多台的速度增长。作为波谱解析课中的一个组成部分，前几节中已从NMR一般原理，参数、新技术和应用及解析多方面进行了阐述和讲解，下面就以NMR实验技术为主概括性的讲以下四部分：一、NMR技术的起源与发展二、液体NMR谱仪的基本结构和对样品的要求三、实验技术，方法,特点和选择四、实验技术的新进展一、NMR的起源与发展1、原理的发现核磁共振（NMR）现象是于1946年由美国斯坦福大学F.Bloch和哈佛大学的E.M.Purcell领导的两个研究小组分别在水和石腊中观察到质子在静磁场里对射频（RadioFrequency,RF）辐射的共振吸收现象，即NMR现象。因此，他们两人获得了1952年的诺贝尔物理学奖。自从1948年由Bloch教授的几位学生参于制造NMR谱仪后，60多年来核磁共振不仅形成为一门有完整理论的新兴学科——核磁共振波谱学，并且各种新的实验技术不断发展，仪器不断完善，在化学、生物、医学、药物等许多领域得到了广泛的应用。2、谱仪发展过程从最初的NMR谱仪，经历了三次大的革命，由不同类型的NMR波谱仪，可按不同的方式进行分类。例如：a.按激发和接收方式可分为：连续波发射，分时发射和脉冲发射谱仪；b.按磁体的性质分为：永磁、电磁和超导磁体谱仪。连续波永磁谱仪结构简单，易于操作，但由于灵敏度太低，80年代已淘汰了。70年代初发展了电磁体NMR谱仪使磁场强度一直加大，高时可达100兆，磁体重2.7吨，而且耗电量也很大。随着超导技术、电子技术和计算机技术的发展，脉冲付里叶变换高分辩超导NMR仪在近二十年来发展很快。场强由88年的600兆，94年的750兆，98年的800兆至2000年10月900兆。现在已有1000兆高场谱仪上市。从NMR实验技术看经历了四个过程:a、一维1H谱，连续波检测小分子结构。b、脉冲付里叶变换实验，检测1H，13C和一些多核谱图，如31P，15N等等（场强较高下完成）。c、二维、三维和多维谱的发展随着超导磁体的引入，计算机及电子技术的进一步发展，使得二维和多维核磁共振技术在80年代末，90年代初发展很快，各种多脉冲实验层出不穷，NMR技术变得更完善，更多样化和更具有针对性的分析研究样品。d、梯度场的发展脉冲梯度场技术是90年代初用于NMR谱仪分析研究的，一经应用于NMR分析，其优点很快的体现出来了，如利用梯度脉冲探头可以在3分钟之内测试一个H-HCOSY。大家知道匀场是做好NMR谱图的关键，也是每个NMR操作者的基本功，以前为了匀场有时需要几十分钟或更长时间，现在只需40多秒。3、NMR技术的应用迄今为止，比较完善的NMR技术广泛的应用于化学、医学、生物学，药理学，生物化学和药物学等领域，应用之广是很难全面概括的，正因为如此，1991年诺贝尔化学奖授予了瑞士苏黎世联邦理工学院的NMR专家R.R.Ernst教授，这不仅是对Ernst教授为核磁共振的发展作出杰出贡献的表彰，也是对核磁共振在化学领域和其它学科发挥重要作用的肯定。很少有一项技术多次获得诺贝尔奖，从该技术应用分类，主要有以下几类：a、医学和医学功能成像研究在医院主要用于疾病的诊断（MRI）场强一般在100兆-200兆以内。近年来，NMR成像的应用领域不断扩大，研究对象遍及人体，动物、植物、矿物以及各种天然或人工合成材料，并逐渐形成了不同的分支学科，成像仪也逐渐发展成适合于不同用途和不同研究对象的各类专用成像系统，如功能成像所用场强最高的达到9个特斯拉(Ts)。b、固体NMR研究主要研究无机物、化工多聚物和高分子材料等方面的研究工作。c、液体核磁的应用研究分子结构和分子运动等现象，确定化合物结构。药物代谢产物和代谢组学的研究。连续波（CW－NMR）发展时期（50年代到60年代中期）：1H、13C、19F和31P谱的应用。脉冲傅立叶变换核磁共振（PFT-NMR）：1965到70年代，瑞士科学家R.Ernst引入并发1946年发现核磁共振现象。F.Purcell和E.M.Bloch分享1952年诺贝尔物理学奖。展了脉冲傅立叶变换核磁共振。从CW－NMR到PFT－NMR是NMR技术的一次质飞跃。二维核磁共振：1971年，Jeener首次提出二维核磁共振；1975～1976年间R.Ernst从理论和实践两方面对2DNMR进行了深入的研究，R.Ernst获1991年诺贝尔化学奖。90年代，三维、四维NMR；高场（600～900兆）谱仪的出现及梯度场技术的发展。生物大分子的溶液结构测定：2002年10月瑞士科学家库尔特·维特里希（WüthrichK.）因发明了利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法而获得诺贝尔化学奖。核磁共振成像：2003年10月,美国科学家劳特布尔(PaulC.Lauterbur)和英国科学家曼斯菲尔德(PeterMansfield)因在核磁共振成像技术领域的“突破性成就”而获得诺贝尔生理学或医学奖。核磁共振与诺贝尔奖YearDevelopmentNature1970FTNMRInstrumental1975SuperconductingmagnetsInstrumental19802DNMRMethodological1985ProteinstructuredeterminationMethodological1990Isotopelabeling/multidimensionalNMRMethodological1990PulsedfieldgradientsInstrumental/Methodological1995NMRscreeningMethodological1997TROSYMethodological1998LC-NMR/LCMS-NMRInstrumental2000CryoprobesInstrumentalNMR发展的里程碑超导核磁共振谱仪磁体Principlesofasuperconductingmagnet123445678211.PortsforliquidN22.PortsforliquidHe3.Superinsulationandhighvacuum4.Mainmagnetcoils+liquidhelium5.Sampleliftandspinnerassembly6.NMRtube7.Shimassembly8.Probe-head3超导核磁共振谱仪计算机信号接收器锁信号接收器场调节装置观测道锁通道去偶道探头PrinciplesofanNMRspectrometer样品管不同场强仪器灵敏度的比较SensitivitiesDecasaccharid(zgpr,NS=64)800MHz600MHz400MHzSignal/Noiseratio(forH1(Man-4'))1680:11130:1594:1不同场强谱峰分散度的比较4006008001000120014001600180020002200240026002800Hz800MHz600MHz500MHz400MHz300MHz胆固醇1、样品要求：人们往往把注意力集中在谱仪操作上，而忽视样品准备。作为样品提供者来说所关心的是得到一个信噪比好、分辩力高的谱图。所以，花几分钟把样品准备好，可以节省几小时的谱仪的操作时间，同样，处理好的纯样品可以得到可靠，准确的结构（分离手段的应用与纯度非常重要）信息。样品越纯越好(无杂质、水、溶剂和盐）样品量：5～15mg样品能很好地溶于某种常用的有机溶剂常用氘代试剂：氯仿、丙酮、二甲基亚砜、甲醇、重水、吡啶样品有足够的稳定性在采集1D、2D谱过程中不应发生变化二、液体核磁共振谱分析对样品的要求2、溶剂选择选择溶剂首先要考虑溶解性，要避免溶剂峰遮盖谱峰，一般氘代试剂的氘化纯度在99.5%到99.99%，以上溶剂无论怎样纯总会出现一些未氘化的残留峰和杂质峰，尤其是溶剂中的H2O峰常常大于残留峰，如DMSO-d6，C5D5N等，要熟悉所用的氘待试剂可能出现的杂质峰对解析谱图十分重要，见图（5）画出了常用氘化试剂的杂质峰。溶解度对观察线宽影响很大，氢谱尤为突出，常用NMR溶剂分为粘性（苯，二甲基酰胺、二甲基亚砜、吡啶、甲苯和水）和非粘性溶剂（丙酮、乙晴、氯仿和二氯甲烷等）。丙酮常被用做测试分辩力和线型的溶剂。常规NMR应用中，粘度问题不十分重要；含活泼氢溶剂妨碍样品中活泼氢观察，在无活泼氢有机溶剂中观察活泼氢，再用D2O交换确证；如用CDCL3检测1H，加D2O交换。高、低温实验要考虑溶剂的溶点，沸点以及温度与溶解性的依赖关系。常用高温溶剂有DMSO和DMF，常用低温溶剂是（CD3)2CO和CD2Cl2，含芳香环溶剂，如苯和吡啶会引起化学位移观测值较大改变；最后一点，要考虑氘化试剂的价格，尽量选便宜的溶剂，D2O和CDCL3最便宜，C5D5N、CD3OD和二氧六环最贵，从NMR观点，最受欢迎和常用的溶剂是CDCL3，DMSO和D2O。3、样品管及样品用量:作为一般常观实验，无论是高场谱仪还是一般谱仪对测试样品管要求并不高（做大分子样品和微量样品除外），但样品管必需清洗干净、无残留溶剂和杂质，以免影响测试结果。高场仪器对样品溶剂的体积要求很严格，要保证一定的体积主要是考虑样品的匀场和接收信号线形正常，另外，是送样量的要求，分了量在300~500的样品，用样量5mg左右。测13C谱得加倍量。谱图的灵敏度主要取决于样品的摩尔浓度。4、样品的处理:要得到高分辩的谱图，溶液中绝不能有悬浮的灰尘和纤维。一般情况下用棉花和滤纸把样品直接过滤到样品管中。测试微量样品时，要带手套处理样品，以防手指上的微量物质溶在溶液中，否则1H谱中1.4ppm会出现一个7Hz裂分的双峰，4ppm还有一个四重峰，可能来自丙氨酸或乳酸。常用氘代溶剂化学位移值溶剂1H谱峰型13C-谱峰型CDCL37.26单峰77三重峰DMSO-d62.493.3五重峰39.5七重峰(CD3)2CO2.042.8五重峰29.8206七重峰CD3OD3.254.78五重峰49七重峰D2O4.8单峰\需加TSP-d4C5D5N7.19;7.55;8.71三重峰149.9;135.5;123.5三重峰C6D67.16单峰128单峰CD2CL25.31.5单峰53单峰CD3CN2.0单峰1.3118.2单峰1、一维谱图1)1H谱1H-谱是结构测定中应用最普遍的方法。根据谱图可提供：a、化学位移，b、偶合常数，c、积分值。从实验上看也很简单只有一个90°脉冲，经FT变换后得谱图（图6）。经过多年的集累分析，绝大多数类型的化合物都有1H谱的化学位移，归属数据和有关图谱库可查阅。根据图谱的数据，大致可以知道化合物的类型，分子结构的大小纯度从而考虑进一步测试的项目。三、NMR实验技术与方法，特点，解决问题和选择方法。2)13C-谱以单脉冲检测高频振荡的13C信号，对1H质子全去偶，得到碳谱。优点：a、信息量大，碳原子构成了有机化合物的骨架，掌握有关碳原子的信息在结构鉴定中有重要意义，从这一角度看，碳谱的重要性大于氢谱。例如：六取代苯环、乙烯四取代饱和碳原子的取代等，从氢谱上是不能得到直接信息的。b、分辨力好。常见有机化合物氢谱的δ值很少超过10ppm，而碳谱的变化范围可超过200ppm，由于碳谱的化学位移变化范围比1Ή谱大十多倍，化合物结构上的细微变化可望在碳谱上得到反映。这是氢谱不能比的。缺点：灵敏度小。自然界中的碳元素大部分是自旋比为零的12C（~98.9%），13C为1.