O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法

O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法摘要：本发明提供了一种O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫病毒纳米粒（NDV/LaSota-O-2-HACC-NPs）的制备方法。近年来对载药壳聚糖纳米微粒的研究取得了重大进展，成为载体药物技术领域的重要发展方向，但此类载体仍存在下列问题。首先，壳聚糖的溶解性较差，不溶于水和有机溶剂，仅在稀酸中少量溶解，而酸性条件制备壳聚糖纳米药物载体势必对大分子药物的活性产生影响，也在很大程度上限制了纳米药物的产业化制备。因此，对壳聚糖予以改性，改善壳聚糖的水溶性，在适宜(或不影响药物活性)条件下制备纳米药物载体急需研究的课题。壳聚糖是一种亲水性物质，它仅能包裹一些亲水性大分子，而对于疏水性药物，壳聚糖要作为载体还存在难度。疏水性强的纳米粒易与肠上皮细胞进行生物粘附，而离子化和具有强亲水链表面的纳米粒不易被胃肠道粘膜粘附。疏水性强的纳米粒易于被摄取，因为疏水性纳米粒易于被生物粘附并且对M细胞有更强亲和力。为解决上述问题，本论发明过对壳聚糖进行一定改性，得到带有正电荷的壳聚糖季铵盐：O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（O-2-hydroxypropyltrimcthylammoniumchloridechitosan，O-2-HACC）作为制备载药微球的材料。所得材料在水中及醇溶剂中皆具有良好的水溶性，且与药物模型新城疫病毒液（NDV）通过离子交联的方法进行更好的结合，得到一种新型的载药微球O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫病毒纳米粒（NDV/LaSota-O-2-HACC-NPs）。这种方法简便易操作，制备过程中所需溶剂均为常用试剂，容易获得，成本低，后续处理也较为简单。该载药微球带正电荷因此具有黏膜渗透性和生物黏附性，可以使抗原穿过黏膜屏障与黏膜下的淋巴细胞产生作用，也可以延长其抗原与黏膜的作用时间，延缓抗原被清除。权利要求书一种O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫病毒的新城疫减毒活疫苗纳米粒，其特征在于包括以下步骤：1、O-2-HACC的合成将壳聚糖保护氨基保护，采用ETA与壳聚糖O上的氨基开环反应合成O-2-HACC。2、NDV/LaSota-O-2-HACC-NPs制备采用离子交联法制备NDV/LaSota-O-2-HACC-NPs。3、根据权利要求1所述的O-2-HACC的合成方法，其特征在于该方法的具体步骤为：（1）N-苯亚甲基壳聚糖(b)的合成取壳聚糖粉末a3.0g溶于120ml的10%醋酸溶液中，缓慢加入乙醇60ml后，室温下搅拌30min内逐渐滴加苯甲醛15.8g(149mmol)，继续搅拌1h后，所得产物于烘箱(35℃~50℃)中放置20h。缓慢滴加稀1.2mol/L的NaOH溶液将溶液调至中性，真空抽滤析出的沉淀，并用甲醇多次洗涤所得固体除去未反应的苯甲醛，得纤维状浅黄色固体b。（2）O-季铵盐-N-苯亚甲基壳聚糖(c)的合成b2.75g置于圆底烧瓶中，加入异丙醇50ml和2，3-环氧丙基三甲基氯化铵9.0g，水浴70℃搅拌反应16h，过滤，依次用甲醇、丙酮洗涤沉淀，得乳白色固状物c。（3）O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖(d)的合成50ml0.25mol/L的HCl乙醇溶液中加入c3.0g，室温搅拌24h后蒸去大部分乙醇，得胶状物，加入15mlH2O充分溶解，再用丙酮沉淀，过滤，固体于烘箱(80℃)中烘干，得浅灰色固状物d。下图为d的结构式。ONH2OHOOONCl413456122344（4）样品精制取d1.0g溶于20ml蒸馏水中，用足量的丙酮进行沉淀，抽滤，得到的沉淀以少量蒸馏水溶解，置于透析袋中透析48h，并时常更换蒸馏水。待浓缩到一定体积时，加入足量的丙酮重新沉淀，抽滤，固体真空干燥，所得样品供IR和NMR分析用，类似方法精制c。4、根据制备权利要求2所述的NDV/LaSota-O-2-HACC-NPs的制备方法，其特征在于该方法的具体步骤为：（1）取O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖配制成浓度为1.2mg/ml的溶液，然后取5ml并滴加6ml新城疫病毒液，磁力搅拌3min，获得溶液A；（2）溶液A在室温、无菌条件下以1200r/min磁力搅拌30s，然后滴加3.5ml浓度为1.5mg/ml的三聚磷酸钠（TPP），维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌15min，再滴加1ml的PBS，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5min，然后滴加1ml的司班-80，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌5min，获得溶液B；（3）将溶液B于4℃、12000r/min离心20min，取沉淀并用PBS洗三次，然后加入浓度为0.01mol/L的PBS悬浮，获得载新城疫病毒O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒；（4）在NDV/LaSota-O-2-HACC-NPs悬液中体积比1∶1加入质量浓度为5%的蔗糖脱脂奶（含1%的海藻糖），真空冷冻干燥24h，获得新城疫O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒LaSota系活疫苗，简称为NDV/LaSota-O-2′-HACC-NPs/LV。5、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于权利要求3的步骤（1）所述的壳聚糖的脱乙酰度大于85％。6、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于权利要求3的步骤（1）所述的醋酸溶液的体积分数为5-15%。7、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于权利要求3的步骤（1）所述的所得产物N-苯亚甲基壳聚糖于烘箱(35℃~50℃)中放置20h。8、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于权利要求3的步骤（1）所述的NaOH溶液为1.0-2.0mol/L，真空抽滤析出的沉淀，用甲醇多次洗涤除去未反应的苯甲醛。9、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于权利要求3的步骤（2）所述的ETA与N-苯亚甲基壳聚糖的质量比为1∶1-9∶1。10、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于权利要求3的步骤（2）所述的反应温度为60-85℃，反应时间为12-20h。11、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于权利要求3的步骤（2）所述的采用分批加料的方式逐滴加入ETA的异丙醇溶液，整个反应在N2保护条件下进行，反应结束后冷却至室温，加入冷藏处理的无水乙醇浸泡，抽滤后使用冷冻干燥。12、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于权利要求3的步骤（3）所述的HCl乙醇溶液为0.2-0.5mol/L。13、根据权利要求1或3所述的方法，其特征在于权利要求3的步骤（4）所述的O-2-HACC采用去离子水溶解，3G砂芯漏斗过滤，冷藏处理的丙酮沉淀的方法进行精制。14、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于所述的模型药物为20-300nm的L系新城疫病毒粒子。15、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（1）所述的模型药物新城疫病毒液在制备纳米粒子前经过了去离子化处理。16、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（1）所述的O-2′-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的浓度为0.5～2mg/ml。17、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（1）所述的滴加新城疫病毒液的体积为1.25～7.5ml。18、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（2）所述的搅拌速度900～1300r/min。19、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（2）所述的三聚磷酸钠（TPP）的浓度为0.5～3mg/ml，维持在5min内匀速滴完。20、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（2）所述的三聚磷酸钠（TPP）加完后继续磁力搅拌8～30min，再滴加1ml的PBS，维持在5min内匀速滴完。21、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（2）所述的PBS加完后继续磁力搅拌8～30min，滴加1ml的司班-80，维持在5min内匀速滴完，继续磁力搅拌8～30min，获得溶液B。22、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（3）所述的离心速度为8000-13000r/min，时间为10-30min，23、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于权利要求4的步骤（4）所述的NDV/LaSota-O-2-HACC-NPs悬液与5%的蔗糖脱脂奶（含1%的海藻糖）的体积比1∶1。24、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于NDV/LaSota-O-2′-HACC-NPs制备完成后需要离心，用PBS洗三次，然后加入浓度为0.01mol/L的PBS悬浮。25、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于NDV/LaSota-O-2′-HACC-NPs制备完成后需真空冷冻干燥24h。26、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于制备的NDV/LaSota-O-2′-HACC-NPs平均粒径为303.5nm。27、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于所述的NDV/LaSota-O-2′-HACC-NPs表面平均电位为+46.36mv。28、根据权利要求2或4所述的方法，其特征在于所述的纳米粒子的包封率可达95.68%。说明书技术领域本发明涉及O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖的合成方法及O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖新城疫减毒活疫苗纳米粒的制备方法。背景技术壳聚糖以其独特的结构使壳聚糖以及壳聚糖衍生物在医药农业食品及非食品工业方面都有广泛的用途，被认为是一种新型的发挥高超功能的生理学材料所有这些用途源于它们多样的生物学功能特别是生物相容性和完整的降解能力及降解过程中代谢产物极低的毒性。近年来对载药壳聚糖纳米微粒的研究取得了重大进展，成为载体药物技术领域的重要发展方向，但此类载体仍存在下列问题。首先，壳聚糖的溶解性较差，不溶于水和有机溶剂，仅在稀酸中少量溶解，而酸性条件制备壳聚糖纳米药物载体势必对大分子药物的活性产生影响，也在很大程度上限制了纳米药物的产业化制备。因此，对壳聚糖予以改性，改善壳聚糖的水溶性，在适宜(或不影响药物活性)条件下制备纳米药物载体急需研究的课题。其壳聚糖是一种亲水性多仅能包裹一些亲水性大分子，而对于疏水性药物，壳聚糖要作为载体还存在难度。疏水性强的纳米粒易与肠上皮细胞进行生物粘附，而离子化和具有强亲水链表面的纳米粒不易被胃肠道粘膜粘附。疏水性强的纳米粒易于被摄取，因为疏水性纳米粒易于被生物粘附并且对M细胞有更强亲和力。本论发明过对壳聚糖进行一定改性，得到带有正电荷的壳聚糖季铵盐：O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（O-2-hydroxypropyltrimcthylammoniumchloridechitosan，O-2-HACC）作为制备载药微球的材料。所得材料在水中及醇溶剂中皆具有良好的水溶性，且与药物模型新城疫病毒液（NDV）通过离子交联的方法进行更好的结合，得到一种新型的载药微球O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖负载新城疫病毒纳米粒（NDV/LaSota-O-2-HACC-NPs）。此法简便易操作，制备过程中所需溶剂均为常用试剂，易获得，成本低，后续处理也较为简单。该载药微球带正电荷因此具有黏膜渗透性和生物黏附性，可以使抗原穿过黏膜屏障与黏膜下的淋巴细胞产生作用，并且可以延长其抗原与黏膜的作用时间，延缓抗原被清除。发明内容1、本发明的目的是提供一种采用氨基保护法将壳聚糖N上的氨基保护，ETA与壳聚糖O上的氨基开环反应合成O-2-HACC，并利用该纳米粒负载病毒的纳米疫苗制备方法。2、本发明的技术方案是把2,3-环氧丙基三甲基氯化铵（ETA）连接到氨基保护后的壳聚糖（CS）上，形成O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖（O-2-hydroxypropyltrimcthylammoniumchloridechitosan，O-2-HACC）；之后，再用离子聚合法制备O-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖纳米粒（O-2-HACC/N,O-CMC-NPs）。该发明采取新城疫病毒（L系）作为模型药物。3、本发明包括以下步骤：（1）O-2-HACC的合成1）N-苯亚甲基壳