4第四章病毒的遗传分析

第四章病毒的遗传分析教学基本要求：1．了解噬菌体的繁殖方式，掌握烈性噬菌体、温和型噬菌体、原噬菌体、溶源性等概念2．掌握噬菌体的突变型，快速溶菌突变体,寄主范围突变体,条件致死突变体(“温度敏感”突变、“抑制因子敏感”突变)、无义突变与无义抑制基因等概念3．理解并掌握噬菌体的重组实验、互补测验和缺失作图遗传分析的原理和方法。)学时数：2学时病毒(virus)既不同于原核生物，也不居于真核生物，因为它们没有一般的细胞结构．在病毒中没有合成蛋白质外壳所必需的核糖体，所以只能寄生在动物、植物和细菌的细胞内繁殖，它能使宿主细胞的机构转而合成它自身新的病毒物质。尽管病毒能形成晶体．自身不能进行代谢等，但仍将病毒视为生物，因为它们能够繁殖。病毒离开宿主细胞虽然不能繁殖，但仍可以存活。根据宿主细胞的不同而将病毒分为动物病毒、植物病毒和细菌茵病毒3种。细菌病毒又称噬茵体(phage)。后来发现真菌及藻类中都有病毒．这些病毒也都称为噬茵体。在前面几章的学习中，我们知道，真核生物基因传递方式的主要特征是：减数分裂。因而产生分离、交换和重组现象。这是真核生物有性过程的反映。与真核生物相对的一种生物，原核生物，它们没有明显的核膜，甚至没有细胞结构，他们的遗传方式又是怎样的呢?第一节噬菌体的繁殖和突变型一、噬菌体的结构二、噬菌体的繁殖1．烈性噬菌体（virulentphages）概念：使宿主菌发生裂解的噬菌体。繁殖：吸附在特异的受体上→酶→细胞壁形成微孔→注入核酸→停止细菌的代谢→合成phage的成分→裂解，释放。如下图：2．温和型噬菌体（temperatephage）具有裂解和溶源两种途径：(1)裂解途径：和烈性噬菌体相同，如右图。(2)溶源途径：溶源周期经诱导进入裂解周期3、溶源性：有些细菌带有某种噬菌体，但并不立即导致溶菌，这种现象称为溶源性，具有溶源性的细菌称为溶源性细菌（lysogenicbacteria），受温和噬菌体感染的细菌，几乎都成为溶源菌。在细菌中处于潜伏状态的噬菌体称为原噬菌体（prophage）或原病毒（provirus），带有原噬菌体的细菌称溶源性细菌（lysogenicbacterium），失去原噬菌体的细菌和为非溶源性细菌（non－lysogenicbacterium）。溶源性细菌有两个重要特性:(1)免疫性：原噬菌体产生一种阴遏蛋白，抑制同类噬菌体DNA的复制，因而能抵抗同类噬菌体的超感染。(2)可诱导性：自发――万分之一；紫外线或丝裂霉素90%。三、噬菌体的突变型噬菌斑（plaque）：由于噬菌体的侵染，使细菌细胞裂解，有菌落上出现的一些园形而清亮的小洞。1、快速溶菌突变体(1)野生型r+形成小的噬菌斑1mm，周边有朦胧的光环。原因：有两个以上的噬菌体侵染一个细菌时，出现溶菌阻碍现象，混有裂解和未裂解的细胞。(2)快速溶菌突变体r（rapidlysis）形成大的噬菌斑2mm，边缘清晰。原因：无溶菌阻碍现象。(3)鉴别：噬菌斑大小。2、寄主范围突变体(1)野生型h+能感染野生型的大肠杆菌Ttos，但不能感染Ttor(2)突变型h对Ttos和Ttor都能感染。(3)鉴别：混合Ttor和Ttos，野生型h+出现混浊噬菌斑，突变型出现清亮噬菌斑。(4)噬菌体与细菌的关系—侵染与抗性。3、条件致死突变体所谓条件致死突变型，就是在某些条件下，这些突变型是致死的，那么这些条件就称为限制条件(restrictivecondition)；而在另一些条件下仍可进行繁殖，从而得以扩增进行研究，所以这些条件称为许可条件(permissivecondition)。人们有可能在许可条件下繁殖突变型，在限制条件下研究突变基因在发育过程中的效应。常用的有两大类条件致死突变：（1）“温度敏感”突变(temperaturesensitivemutation)：野生型噬茵体能在很大的温度范围内感染宿主并进行繁殖。①热敏感突变型(heatsensitivemutants，ts)：通常在30℃(许可条件)感染宿主进行繁殖，但在40一42℃(限制条件)条件下就是致死的，不能形成噬菌斑；②冷敏感突变型(coldsensitivemutation，cs)：在较低温度下就是致死的。原因：温度敏感性几乎总是一种突变的结果，基因突变后所编码的蛋白质中有一个氨基酸的替换，而这种蛋白质在“限制温度”下不稳定而丧失活性。（2）“抑制因子敏感”突变(suppressor-sensitivemutation,sus)：实质是原来正常的密码子变成了终止密码子，因而翻译提前终止，不能形成完整肽链而产生有活性的蛋白质，属于无义突变（nonsencemautation）。带有sus突变的噬菌体在感染一种带有抑制基因(suppressor,su＋)(许可条件)的宿主菌时能产生子代，但在感染另一种没有抑制基因(su－)(限制条件)的宿主菌时，不能产生子代。野生型噬菌体在这两种宿主中都能产生子代。sus突变不像“宿主范围突变”那样影响噬菌体对宿主的吸附，这种突变的噬菌体能正常地吸附、注入自身的DNA，杀死宿主细胞，但不产生子代。sus突变分为三类；无义抑制基因（su＋）实质：tRNA基因发生了突变，例如琥珀型抑制基因‘su3＋’在UAG密码于上插入了一个酪氨酸，这是因为tRNA加基因的反密码子的一个突变，tRNATry，正常的反密码于是GUA，它按摆动规则译读酪氨酸密码子UAU(C)。‘su3＋’菌株的tRNATry含有反密码子CUA，它识读琥珀型密码子UAG，并插入酪氨酸而防止终止。第二节噬菌体突变型的重组实验一、T2噬菌体突变型的两点测交可望出现四种基因型亲本型：h+r-h-r+重组型：h+r+h-r-[实例]不同的快速溶菌突变型，在表型上也不相同。记作ra，rb，rc。确定4个基因ra，rb，rc，h的连锁图。用不同快速溶菌突变型rxh+与宿主范围突变型r+h杂交，结果见表。根据每一杂交作一连锁图:4个基因的连锁关系有4种可能图示进行rcrb+×rc+rb,把得到的重组值与rb—h比较,知rc－rbrb－h，所以是rc－h－rb确定ra在h的哪一边，不能单是把ra×rbra×rc来回答。因为资料得不出明确的答案。只有当很多的T2品系发现后，进行广泛的遗传学作图。才发现两种排列顺序都是正确的。原来T2噬菌体的连锁图也是环状的。二、T4噬菌体突变型的三点测交突变型：小噬菌斑(m)、快速溶菌®、浑浊溶菌班(tu)三、ΦX174突变型的二点、三点测交1、二点测交（1）杂交：感染su+（2）检测子代噬菌体总数：用带有合适的su＋基因的宿主菌(指示菌)作噬菌斑检测（3）野生型子代噬菌体总数：用su－指示菌作噬菌斑检测2、三点测交必须选择两个标记的野生型重组体。现以amAtsC×amB(amAtsC十×十十amB)三因子杂交为例：在两点测交中已知amA与amB之间距离较近，而这两位点到tsC的距离较远。那么在许可温度下把杂交子代噬菌体倒在su—指示菌上，tsC是一种非选择标记，因为在许可温度下，tsC也可正常生长，在su－上选择的两个琥珀突变的野生型重组子，不论是带有tsC还是ts5C＋都会产生噬菌斑。然后在限制温度下分析这些重组噬菌体tsC与tsC＋所占比例，从而确定这3个基因排列顺序：运用间隔联结的非选择性标记tsC确定噬菌体三点测交中标记次序基因顺序：tsC－amA－amB四、烈性噬菌体的遗传体制①噬菌体在杂交中，每个亲代对子代所提供的遗传贡献取决于感染细菌时每种亲代噬萄体的相对数量；②噬菌体的基因重组是发生在噬菌体的DNA复制以后，重组型和亲本型一起复制；③噬菌体不同基因型之间可以发生多次交换；④在噬菌体中基因重组频率可以随着宿主细胞裂解时间的延长而增加，直到DNA与外完蛋白装配成为完整的噬菌体时，重组才停止。因此噬菌体杂交时，应该注意：①控制每种亲代噬菌体基因型的投放量：②控制允许发生复制和重组的时间。只有控制这两个因素并在标准条件下进行杂交所得重组频率才能用于绘制近似的遗传图。五、Benzer的重组测验1955年，美国的S.Benzer（本泽）用大肠杆菌T4噬菌体作为材料，研究快速溶菌突变型rⅡ的基因精细结构，发现在一个基因内部的许多位点可以发生突变，并可以在这些位点之间发生交换，从而说明一个基因是一个功能单位，但并不是一个突变单位和交换单位，因此，一个基因可以包括许多突变单位和许多重组单位。噬菌体T4感染E.coli引起溶菌，有一组T4突变型，产生大而边缘清楚的噬菌斑，叫做快速溶菌（rapidlysis）。而野生型噬菌体的噬菌斑小而边缘模糊。Benzer对一组叫做rⅡ的速溶突变型进行详细而深入的研究。rⅡ区中有3000多个突变型，它们都有相同的表型。利用菌株B和很容易鉴别突变型和野生型。表4-1T4的突变型rⅡ和野生型rⅡ+在不同菌株上的噬菌斑类型不同大肠杆菌菌斑平板上的表型BK(λ)S野生型rII+小噬菌斑小噬菌斑小噬菌斑rII大噬菌斑无噬菌斑（致死）小噬菌斑重组测验：（recombination），Benzer把rⅡ突变型一对对地杂交，测量每对突变位点间的重组频率。如rx+ry在许可条件下双重感染B菌株，形成噬菌斑后收集菌液，稀释后分成两份，一份再接种到B菌株，这样，rx+，+ry，rxry，++都能生长，另一份接种于K(λ)，在这里，只有++重组子才能生长，交互重组子rxry不能生长。图示这种方法测定重组频率是极其敏感的，重组的检出率可达1/106，理论上可测得0.002%的重组值，但实际上所观察的最小重组频率为0.02%。根据二点杂交的结果，可以作成连锁图（图4-3）。第三节噬菌体突变型的互补测验一、Benzer的互补测验Benzer分析了rⅡ区域大约2000个（有些不能重组）突变型，知道这些突变分布在308个（能重组）位点上。那么，这308个位点是属于一个基因还是几个基因?为了划分这种功能单位界线，必须进行互补测验。(1)互补作用：两个突变型细胞的两条同源染色体同处在一个杂合体细胞或局部合子时，野生型基因补上偿突变基因的缺陷而使细胞的表型恢复正常的作用。否则，两种突变型一定具有相同功能损伤。(2)反式构型：两个突变分别位于两条同源染色体上的基因组合。顺式构型：两个突变位于同一个染色体上的基因组合。图示。(3)互补测验（complementationTest）（顺反位置效应测验）:比较顺式和反式构型的细胞，从而判断两个突变是否属于同一基因的测验——测验基因间是否互补。Benzer用不同的rⅡ突变型成对组合去感染大肠杆菌K（λ）菌株，图示。他发现:rⅡ突变型可分成rⅡA和rⅡB两个互补群。所有rⅡA突变型的突变位点都在rⅡ区的一头，是一个独立的功能单位；所有rⅡB突变型的突变位点都在rⅡ区的另一头，凡是属于rⅡA互补群的突变不能互补，同理属于B互补群的突变也不能互补，只有rⅡA的突变和rⅡB的突变可以互补。二、顺反子、突变子与重组子的概念1、顺反子（cistron）：Benzer把在反式构型中不能互补的各个突变位点在染色体上所占的一个区域称为一个顺反子。顺反测验结果表明，顺反子是一个必须保存完整才具胡正常生理功能的遗传物质最小单位。实际上它是基因的同义词。是一个功能水平上的基因。rⅡ区内，有两个基因，但可在许多位点发生突变和重组。2、突变子（muton）：是指一个顺反子内部能发生突变的最小单位。一个突变子可以小到只有一对碱基。如镰形细胞贫血症:HbS和HbA。这对基因的差别只是β链第6位氨基酸谷氨酸变为缬氨酸:DNA→mRNA→蛋白质正常HbA:CTTGAA谷氨酸↓镰形HbS:CATGUA缬氨酸3、重组子（recon）是基因内不能由重组分开的遗传单位，即基因内出现重组的最小区间。重组子的单位可以小到核苷酸对。Benzer的重组测验中最低的重组值为0.01%。总结：每个顺反子在染色体（DNA）上的区域称为基因座（locas），而每个基因座上有许多突变位点（site），它是一个顺反子内部能发生突变的最小结构单位，称为突变子；一个突变可以小到一对碱基，我们知道，DNA中