5-FU代谢酶基因型多态联合检测与胃肠癌化疗的评估--已打印

1江苏省科技计划项目任务书项目名称：5-FU代谢酶基因型多态联合检测与胃肠癌化疗的评估承担单位：江苏省肿瘤医院所在地区：南京市单位地址：南京市玄武区百子亭42号邮编：210009项目负责人：陆建伟电话：3283510主管部门：江苏省卫生厅申报日期：2003年05月16日江苏省科学技术厅二ΟΟ三年制一、立项依据1、本项目国内外科技创新发展概况和最新发展趋势；胃肠道癌是最常见的恶性肿瘤。目前我们收治的病例多数为进展期，单纯手术常难以根治，化疗在综合治疗中发挥了重要作用，成为治疗胃肠道癌的主要方法之一。5－氟尿嘧啶（5－FU）是治疗胃肠道癌最常用的化疗药物之一。5－FU进入体内后，大约85％的药物被二氢嘧啶脱氢酶（DPD）灭活。其余部分被胸苷磷酸化酶转化成FUdR。在胸苷激酶的催化下，FUdR进一步磷酸化为有活性的5—FU代谢物，5－氟－2－脱氧尿苷一磷酸(FdUMP)。在还原型叶酸辅因子即5，10—亚甲基四氢叶酸（MTHFR）存在条件下，FdUMP与胸苷酸合成酶（TS）形成一种稳定的共价络合物。TS能催化dUMP形成dTMP，TS导致dTMP的耗竭，从而干扰DNA的合成和修复。因此在这个过程中，DPD、TS以及MTHFR表达增高将对5－FU的抗瘤活性和毒性具有一定的影响。DPD是一种5－FU分解代谢限速酶。在不同个体中，其活性最大波动范围可达20倍。DPD活性低的患者不能有效灭活5－FU，导致过量生成5－FdUMP，从而引起致命的胃肠、血液、神经毒性，反之，则降低5－FU的抗瘤作用。目前认为DPD存在遗传性缺乏。迄今至少报道了20种与DPD活性降低相关的基因突变。在人群中，3％～5％的个体携带灭活DPD的基因突变杂合子，0．1％的个体携带DPD基因突变纯合子。认为约50％的DPD灭活等位基因是非功能性等位基因。是由邻接DPYD基因第14外显子的GT拼接供位恒定区发生了G→A转位突变所致。该等位基因（各为DPYD＊2A）导致第14外显子的遗漏（不表达），从而引起一种无功能的蛋白质表达。一些研究认为DPYD＊2A等位基因与5－FU化疗引起的毒性和疗效相关[1]。但是在一些5－FU严重毒性反应的患者中并没有检测到DPYD基因编码突变[2]。使DPD活性调控分子机制变得错综复杂，需要扩大病例进一步研究。已经证实TS基因的遗传多态性对5－FU的化疗疗效具有较大的影响。TSmRNA和蛋白水平均与5－FU的临床抗肿瘤效应呈负相关。TS基因5`端启动子中的一个串联重复序列（TSER）存在多态性。它含有多个拷贝重复序列的等位基因，分别命名为TSER＊2（2R）、TSER＊3（3R）、TSER＊4（4R）、TSER＊5（5R）、TSER＊9（9R）。研究显示2R、3R是最重要的等位基因型[3]。在中国和日本人中3R／3R基因型的发生率（67％）明显高于白种人和西亚人（38％）。许多实验研究认为增加重复序列的数量导致TSmRNA水平及蛋白质表达的升高。2000年Uricht等[4]通过检索表达顺序标签库发现TSmRNA3＇非翻译区的（3＇-untranslatedregion,3＇-UTR）的1494bp处存在6bp核苷酸片段的缺2失或插入。最近我院分子流行病研究室发现TS基因的这一多态性与胃癌的发生有协同关系[5]，但与癌症治疗的关系国内外未见报道。Pullarkatt等[6]发现3R／3R纯合子个体的TSmRNA水平比2R／2R纯合子个体高3．6倍，比2R／3R杂合子个体高1．7倍。在50例结直肠癌病例中，2R／2R纯合子患者的5－FU化疗的有效率（50％）明显高于3R／3R纯合子（9％）和2R／3R杂合子（15％）患者。Yoshinori等[7]对115例术后口服5－FU化疗胃癌病例进行TS基因型分析，发现3R／3R纯合子患者的生存明显差于2R／2R和2R／3R患者。因此胃肠道病人TS基因型的遗传多态性的检测有可能成为5－FU化疗疗效的预测指标。MTHFR是调节叶酸代谢的限速酶。MTHFR的底物5，10－亚甲基四氢叶酸参与TS将脱氧尿苷(dUMP)转化为脱氧胸苷一磷酸(dTMP)的过程。同时5，10－亚甲基四氢叶酸通过MTHFR代谢成为5－甲基四氢叶酸，后者再经蛋氨酸合成酶的催化作为甲基供体使同型半胱氨酸转化为蛋氨酸。研究发现MTHFR具有基因遗传多态性，其中最常见的是677C→T多态和1298A→C多态，前者在677位点发生C→T改变，后者在1298位点发生A→C改变，MTHFR基因这两个位点的改变都使其编码的酶活性显著降低。从而导致叶酸代谢障碍，使5，10－亚甲基四氢叶酸积聚。中国人MTHFR677C→T变异基因型（C／T＋T／T）拥有者的比例（68．5％）高于西方人群（55．3％），欧美人群中MTHFR1298A→C变异高于东亚地区人群。我院分子流行病研究室在国内外率先进行了MTHFR基因多态与胃癌关系的研究，并发现胃癌患者的677C→T变异基因型比例占79．4％[8]。加拿大作者Cohen等[9]发现结直肠癌患者MTHFR677C→T变异基因型的比例为61％，研究显示拥有纯合子（C／C）基因型患者经5－FU为主方案化疗的有效率47％，而拥有杂合子和变异型纯合子患者的有效率分别为67％和100％。因此MFHFR基因遗传多态性与5－FU化疗疗效之间具有相关性。综上所述，联合分析DPYD基因型突变与TSER和MTHFR基因的多态性可能成为胃肠道癌患者对5－FU化疗疗效和毒性的预测指标，以及在确定哪些患者需要（TS、MTHFR高表达和DYPD缺乏）选择其它有效的化疗药物来替代5－FU治疗时，显得特别重要。迄今为止，国外对这些基因组仅有检测单一指标的小样本报道，国内仅局限于肿瘤易感性方面的研究，尚无将这些基因组分析结果用于指导临床化疗方面的报道。本研究对5－FU抗癌活性中三个关键酶的基因型多态性进行联合分析，将较全面地阐明胃肠道癌患者5－FU代谢过程中存在的个体差异，从而达到个体化治疗。参考文献：1.M.Raida,W.Schwabe,P.Hausler,A.B.VanKuilenburg,A.H.VanGennip,D.Behnke,K.Hoffken,Prevalenceofacommonpointmutationinthedihydropyrimidinedehydrogenase(DPD)genewithinthe5V-splicedonorsiteofintron14inpatientswithsevere5-fluorouracil(5-FU)-relatedtoxicitycomparedwithcontrols,Clin.CancerRes.7(2001)2832–2839.2.E.S.Collie-Duguid,M.C.Etienne,G.Milano,H.L.McLeod,KnownvariantDPYDallelesdonotexplainDPDdeficiencyincancerpatients,Pharmacogenetics10(2000)217–223.3.H.R.Luo,X.M.Lu,Y.G.Yao,N.Horie,K.Takeishi,L.B.Jorde,Y.P.Zhang,LengthpolymorphismofthymidylatesynthaseregulatoryregioninChinesepopulationsandevolutionofthenovelalleles,Biochem.Genet.40(2002)41–51.4.UlrichCM,BiglerJ,VelicerCM,GreeneEA,et.al.Searchingexpressedsequencetagdatabases:discoveryandconfirmationofacommonpolymorphisminthethymidylatesynthasegene.CancerEpidemiolBiomarkersPrev2000Dec;9(12):1381-55.高长明，吴建中，丁建华，等。胸苷酸合成酶基因多态性和生活习惯、亚甲基四氢叶酸还原酶基因协同作用与胃癌的易感性。中华流行病学杂志，2003；24（7）：43－47（待发表）6.S.T.Pullarkat,J.Stoehlmacher,V.Ghaderi,Y.P.Xiong,S.A.Ingles,A.Sherrod,R.Warren,D.Tsao-Wei,S.Groshen,H.J.Lenz,Thymidylatesynthasegenepolymorphismdeterminesresponseandtoxicityof5-FUchemotherapy,PharmacogenomicsJ.1(2001)65–70.7.IshidaY,KawakamiK,TanakaY,KanehiraE,etal.AssociationofthymidylatesynthasegenepolymorphismwithitsmRNAandproteinexpressionandwithprognosisingastriccancer.AnticancerRes2002Sep-Oct;22(5):2805-98.高长明，吴建中，丁建华，等。亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与胃癌易感性的关系。中华流行病学杂志，2002；23（4）：289－29339．CohenV,Panet-RaymondV,SabbaghianN,MorinI,etal.MethylenetetrahydrofolateReductasePolymorphisminAdvancedColorectalCancer:ANovelGenomicPredictorofClinicalResponsetoFluoropyrimidine-basedChemotherapy.ClinCancerRes2003May;9(5):1611-16152、本项目研究的目的、意义（突出说明对科技、经济和社会发展的作用）；本研究的目的：1．采用PCR技术，分析胃肠道癌患者外周血白细胞DNA中DPYD基因型突变与TS（TSER、TS3'－UTR）和MTHFR（C677T、A1298C）基因型的多态性。2．联合分析DPYD基因型突变与TS和MTHFR基因的多态性与5－FU化疗疗效和化疗毒性的关系。3．联合分析DPYD基因型突变与TS和MTHFR基因的多态性与胃肠道癌患者预后的关系。本研究的意义通过对胃肠道癌患者外周血白细胞DNA中DPYD基因型突变与TS和MTHFR基因型的多态性分析，预测胃肠道癌患者对5－FU化疗疗效和毒性的个体差异，提高5－FU用药的安全性和有效性，避免无效治疗和不良反应，从而降低治疗费用和风险。具有较好社会效益和经济效益。同时通过这些基因组多态性与预后关系分析，为胃肠道癌建立一个新的预后指标。3、本项目研究现有起点科技水平及已存在的知识产权情况（高技术、科技攻关计划附查新报告）；药物基因组学（pharmacogenomics）是上世纪90年代末发展起来的基于功能基因组学（funetionalgenomics）与分子药理学的一门新兴学科。它从基因水平研究基因序列的多态性与药物效应多样性之间的关系，即：研究基因本身及其突变体对不同个体药物作用效应差异的影响。本研究从基因水平上揭示DPYD基因型突变与TS和MTHFR基因型多态性的遗传特征，通过鉴别基因序列中的差异，以5－FU药物效应及安全性为目标，研究DPYD基因型突变与TS和MTHFR基因型多态性与5－FU疗效和安全性之间的关系。因此具有较高科学水平。4、本项目研究国内外竞争情况及产业化前景。本项目的研究内容在国外的大部分报道的是实验室研究结果，与临床化疗相关的报道较少，并且仅局限于大肠癌的小样本单指标检测。国内未见类似报道。本项目是联合检测5－FU代谢过程中的三个关键酶基因组变异，病种是以胃癌为主的胃肠道癌。因此本研究内容属国外、国内领先。二、研究内容1、具