91-特异性抗体的制备

特异性抗体的制备第一节免疫原的制备•一、颗粒性抗原的制备1.细胞抗原的制备：A新鲜血经无菌NS洗涤3次，取压积红细胞并配制成2~5%,直接进行注射免疫。B新鲜血+抗凝剂—4℃保存4W,免疫前取适量抗凝绵羊血，按A处理。C新鲜血去除纤维蛋白原后按B处理。2.细菌抗原的制备：取标准菌株，接种，H抗原:取有动力的菌株液,用0.3~0.5%甲醛处理。O抗原：菌液于100℃2.5h,Vi抗原：杀菌后，加入1%的氯化钙溶液。3.虫卵也可作为抗原，例如日本血吸虫卵悬液。4.组织细胞粗抗原：所用的组织必须是新鲜或处理后低温(-40℃)保存的。器官或组织材料得到后立即去除表面的包膜或结缔组织及大血管，用无菌NS进行灌注、洗涤至没有残血、污物，在冷浴中将组织剪成小块后粉碎(匀浆)/消化。粉碎方法有两种，一是高速组织捣碎机法：将组织+NS装入捣碎机筒中，开机即可，注意要高速(1万rmp)，间断(每次30秒~1min)进行，时间过长会导致产热，破坏抗原。另一种是研磨法(有时加入洗过的海沙使研磨更有效)。匀浆液经2~3千rmp离心，沉淀中含大量的组织细胞和碎片，上清液可提取可溶性抗原。消化是用胃蛋白酶或胰酶，通过酶解将细胞间质消化，获得游离单个细胞。•二、可溶性抗原的制备1.细胞破碎：细胞可溶性抗原可分为：细胞膜蛋白抗原、细胞浆抗原、细胞核及核膜抗原。三种抗原的制备均需细胞破碎，细胞破碎有如下方法：A反复冻融法：置-15~-20℃冻结，然后缓慢融化，反复2次，大部分细胞因胞内冰晶的形成和溶剂浓度的突然改变而被融破。此法适用于组织细胞，对微生物的细胞作用较差。B冷热交替法：将材料投入沸水中，90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中。在细菌或病毒中提取蛋白质及核酸可用此法。C超声波破碎法：是利用超声波的机械振动而使细胞破碎的方法。注意避免长期超声产热。微生物和组织细胞破碎多用此法，但真菌厚膜孢子则较难打破。D酶处理法：酶在一定的条件下能消化细菌和细胞。例如在碱性(pH8.0)下，溶菌酶可专一破坏G+菌细胞壁。此法适用于多种微生物。E表面活性剂处理：在一定的条件下，表面活性剂能与细胞膜脂蛋白形成微泡，使膜的通透性发生改变而使细胞破碎。提取核酸时常用此法。F自溶法：利用组织和微生物的自身酶系，在一定条件下使细胞溶解。2.蛋白质抗原的制备：破碎的细胞按一定要求纯化，可获得不同成分的抗原。蛋白质抗原的制备可采用如下几种方式进行纯化：⑴超速离心法：利用各抗原在梯度液中沉降速度不同，离心后使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度的梯度层内，达到区带分离的目的。这是分离亚细胞部分和蛋白质大分子的有效手段。⑵选择性沉淀：是采用各种沉淀剂或改变条件使抗原成分沉淀而达到分离的目的。A核酸除去法:用DNA/RNA酶降解或用氯化锰/硫酸鱼精蛋白/链霉素作沉淀剂去除核酸。B盐析沉淀法：用不同饱和度的硫酸铵或硫酸钠，可将组织溶液分成若干组分。最常用的盐析剂为33~50%的硫酸铵。例如:用40、35、33%的硫酸铵分次提取或用20%硫酸钠提取，即可获得丙种球蛋白(含IgG95%以上)。C有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的介电常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度降低而沉淀，有些有机溶剂能破坏蛋白质的水化膜而使蛋白质沉淀，例Cohn地温酒精可将血浆蛋白分为五组。IgG属CohnⅢ。D其它沉淀剂：常用聚乙二醇(PEG)和硫酸葡聚糖。PEG浓度3~4%可沉淀IC，6~7%沉淀IgM，8~12%沉淀IgG,12~15%沉淀其它球蛋白，25%则沉淀白蛋白。按此原理设计了快速浊度测定法和IC的测定。⑶凝胶层析法：利用凝胶的多孔网状结构，大分子在凝胶颗粒间很快通过，小分子进入网孔，难于洗脱，将抗原分为大、中、小三种。属区带分离法。⑷离子交换层析：利用带离子基团的纤维或凝胶，吸附带相反电荷的抗原。⑸亲和层析：利用生物学分子间所具有的专一亲和性而设计的层析方法。Ag-Ab,激素-受体，酶-酶配体，酶蛋白-辅酶。3.核酸抗原的制备：细胞破碎液去除蛋白质(常用酚和氯仿抽提)后，用沉淀剂(常用乙醇)沉淀核酸。4.脂多糖抗原的制备：苯酚提取法。5.Ig片段的制备：酶裂解法—Fc、Fab氧化/还原法：轻、重链。6.纯化抗原的鉴定：A含量测定:生化(双缩脲法)测蛋白质含量。B纯度及分子量鉴定：凝胶层析+电泳免疫活性鉴定：双扩，对流免疫电泳。三、半抗原免疫原的制备：利用某些功能团将半抗原连接到载体上。1.载体的选择：A蛋白质:人/牛/兔白蛋白、牛甲状腺球蛋白和血蓝蛋白等。最常用牛白蛋白。B多肽聚合物:多为人工合成(多聚赖氨酸)。C大分子聚合物和某些颗粒:聚乙烯吡咯烷酮(PVP),羧甲基纤维素，活性碳，乳酸等2.连接方法：※A碳化二亚胺法※B戊二醛法※C氯甲酸异丁酯法D琥珀酸酐法E0-羧甲基羟胺法F一氯醋酸钠法G重氮化的对氨基苯甲酸法H-N+-R1.蛋白质-COO-+R-N+H=CN-R’→蛋白质-COO-C-NH-R’H-N+-R蛋白质-COO-C-NH-R’+半抗原-NH2→蛋白质-CO-NH-半抗2.蛋白质-NH+半抗原-NH2+COH-(CH2)3-COH→蛋白质-NH=CH-(CH2)3-CH=N-半抗原3.半抗原-COOH+Cl-COO-CH2CH(CH3)2+蛋白质→半抗原-CO-NH-蛋白质4.四、佐剂：与抗原同时或预先注射于机体，能增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质，称为佐剂(adjuvant)。1.佐剂的条件：A增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增加抗原的免疫原性。B与抗原结合能延长抗原在局部组织中的存留时间，达到持续刺激基团产生高效价的抗体。C可以激活免疫活性细胞，增强体液免疫、细胞免疫和非特异免疫功能。D无毒、无副作用。2.常用佐剂的种类和制备：A铝乳：5%硫酸铝+5%NaOH，反应后NS洗涤沉淀2次以上。1:1与抗原混合。B明矾：硫酸钾铝在一定pH下产生氢氧化铝胶体。制备方法是：Ag+NS,搅拌下缓慢滴入10%的硫酸铝钾溶液，以NaOH校正pH至6.5，离心、NS洗涤。C福氏佐剂：福氏佐剂分为不完全佐剂(石蜡油+羊毛脂)和完全佐剂(石蜡油+羊毛脂+卡介苗)。1:1与抗原混合研磨均匀即可。但完全福氏佐剂局部注射因易形成肉芽肿和持久溃疡而不用于人体免疫。第二节免疫血清的制备一、免疫动物的选择：选择动物时应考虑如下因素：1.抗原与免疫动物种属差异越远越好。2.动物必须适龄、健壮、无感染。3.动物体内有与抗原相类似的物质或其它原因而使该抗原对该动物免疫原性极差，则该动物不能选用。例如：IgE–绵羊，胰岛素-家兔，酶类-山羊等。4.抗血清的用量5.抗血清的要求：例如，马型抗血清用于沉淀反应时较难掌握，因而极少应用。二、免疫方法1.免疫的剂量：应考虑抗原性的强弱、分子量的大小、动物的状态和免疫时间。一般大:0.5~1mg/只，小:0.1~0.6mg/只。2.免疫途径：皮内或皮下免疫采用多点注射(8~10点)。皮内注射易引起细胞反应，对提高抗体效价有利，但皮内注射较困难(因佐剂加入后粘度大)；用明矾作佐剂时，一般用于肌肉注射(因皮下注射易引起肉芽肿和脓肿)；腹腔和静脉注射多用于颗粒性抗原和加强免疫。对宝贵抗原，可采用淋巴结内直接注射抗原(先用完全佐剂在足掌作基础免疫)。半抗原宜皮内多点注射。3.免疫时间：首次和二次免疫之间要间隔约20天，二次以后每次间隔7~10天。第一次免疫后，机体处于识别阶段，若很快第二次注入抗原，极易造成免疫耐受。第二次以后，若间隔时间过长，则刺激变弱，造成抗体效价不高。半抗原的免疫间隔要求较长(30~40天)。如8次免疫后仍不产生抗体，则应更换动物。三、动物采血法：1.颈动脉采血法2.心脏采血法（常用于小动物）3.静脉多次采血法小鼠取血常用摘除眼球或断尾法。第三节抗血清的纯化、鉴定和保存1.抗血清的纯化:亲和层析、吸附法纯化特异性抗体。用40%、35%、33%的硫酸铵盐析三次(或20%的硫酸钠)粗提γ-球蛋白，但仍含5%的其它蛋白。经离子层析、亲和层析纯化Ig或酶解法制备Fab或Fc片段。2.抗血清的鉴定：双扩（特异性、效价）电泳（纯度）。3.抗血清的保存：除菌。A4℃液态保存3~6m.B–20~-40℃保存2~3年，但避免反复冻融。C冰冻干燥，4~5年。第四节、单克隆抗体技术一、单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)是由B细胞杂交瘤产生的只识别抗原分子上一种抗原决定族的抗体分子。二、杂交瘤技术的原理：利用聚乙二醇(PEG)作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞(能分泌某种抗体的B细胞)与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，在HAT培养基的选择作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的单个细胞培养(克隆化)，最终获得既能产生所需抗体、又能不断繁殖的杂交瘤细胞纯系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其后产生的腹水中含有高效价的单克隆抗体。三、操作流程：Ag降植烷佐剂↓I.P.反复↓注射↓I.P.小鼠(BALB/C)小鼠(BALB/C)↓↘骨髓瘤细胞(SP2/O)脾细胞(108)(107)↘50%PEG↙(细胞融合)↓加:饲养细胞(MΦ)HAT培养基(细胞筛选)↓抗体检测克隆化培养↓纯系细胞株四、HAT的作用：HAT培养基是在常用的细胞培养基内添加了3种特殊成分：次黄嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、胸腺嘧啶(T)。1.脾细胞：在体外5~7天内死亡。2.骨髓瘤细胞：一般肿瘤细胞合成DNA有两条途径：一条是主要途径，即由糖、氨基酸合成核苷酸，进而合成DNA，此途径可被氨基蝶呤(A)所阻止。如在培养基中有次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶(T)，即使有氨基蝶呤(A)存在，细胞仍可通过替代途径合成核苷酸，但必须有次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)同时存在时才能完成。小鼠骨髓瘤细胞为HGPRT缺乏的缺陷型细胞，在HAT中，正常合成DNA的途径被氨基蝶呤(A)阻断，又HGPRT缺乏而不能用替代途径，最终只能死亡。3.杂交瘤细胞：合成DNA的途径阻断，但可利用原脾细胞的HGPRT完成替代途径的作用，存活。