植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用

609朱长甫等:植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用6期2004-08-24收到，2004-09-22接受。*通讯作者(E-mail:[e-mail];Tel:[phone];Fax:[phone])。缩写　BCH:Caroteneb-hydroxylase(胡萝卜素β-环羟化酶);CCS:Capsanthin-capsorubinsynthase(辣椒红素-辣椒玉红素合酶);CrtB:Phytoenesynthase(八氢番茄红素合酶);CrtI:Phytoenedesaturase(八氢番茄红素脱氢酶);CRTISO:Carotenoidisomerase(类胡萝卜素异构酶);DMAPP:Dimethylallylpyrophosphate(二甲基丙烯焦磷酸);ECH:Caroteneε−hydroxylase(胡萝卜素ε-环羟化酶);GGPP:Geranylgeranylpyrophosphate(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸);GGPS:GGPPsynthase(牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶);IPP:Isopentenylpyrophosphate(异戊二烯焦磷酸);IPPI:IPPisomerase(异戊二烯焦磷酸异构酶);LYCB:Lycopeneβ-cyclase(番茄红素β-环化酶);LYCE:Lycopeneβ-cyclase(番茄红素ε-环化酶);NCED:Nine-cis-epoxy-carotenoiddioxygenase(VP14，9-顺式-环氧类胡萝卜素双氧合酶);PDS:Phytoenedesaturase(八氢番茄红素脱氢酶);PSY:Phytoenesynthase(八氢番茄红素合酶);VDE:Violaxanthinde-epoxidase(堇菜黄质脱环氧化酶);ZDS:ζ-carotenedesaturase(ζ-胡萝卜素脱氢酶);ZEP:Zeaxanthinepoxidase(玉米黄质环氧化酶)。植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用朱长甫2　陈　星1　王英典1*(1北京师范大学生命科学学院，北京100875；2东北师范大学生命科学学院，长春130024)综　述Review摘要：近年来类胡萝卜素生物合成基因的分离与功能鉴定，为应用基因工程技术改变植物体内类胡萝卜素成份和提高类胡萝卜素含量提供了新的基因资源。有关类胡萝卜素合成的生物化学及其在体内调控研究的新进展，使通过遗传操作调控植物体内类胡萝卜素生物合成途径成为可能。该文综述了类胡萝卜素生物合成途径及其相关基因的研究现状，并结合作者的工作介绍了应用转基因技术改变植物体内类胡萝卜素成份与含量的最新成功的事例。关键词：类胡萝卜素；类胡萝卜素合成基因；基因工程；转基因技术中图分类号：Q74类胡萝卜素是生物体内通过类异戊二烯途径合成而呈现黄色、橙红色和红色的一大类萜类色素物质。所有的光合生物以及许多非光合细菌和真菌均可在体内合成类胡萝卜素。除极少数非光合细菌合成的C30、C45和C50类胡萝卜素外，类胡萝卜素主要是含有40个碳原子的萜类色素。迄今，在自然界中已发现600多种C40类胡萝卜素，主要作为高等植物、藻类和蓝细菌(cyanobacteria)光合膜的重要组成份。类胡萝卜素在植物光合作用中担负着光吸收的辅助色素的重要功能，主要存在于植物叶片的叶绿体以及许多花和果实的有色体中，具有吸收和传递电子的能力，并在清除光合作用中产生的叶绿素三线态和单线态及超氧阴离子等自由基方面起着重要的作用(Bartley和Scolnik1995,Tracewell等2001)。植物类胡萝卜素生物合成途径中的堇菜黄质(violaxanthin)和新黄质(neoxanthin)这两个环氧类胡萝卜素还是植物激素脱落酸(ABA)生物合成的前体(Olson和Krinsky1995)。植物类胡萝卜素也是许多花和果实中的主要色素，用以吸引昆虫、鸟类或其它动物来帮助授粉和传播种子(Bartley和Scolnik1995)，对园艺植物的观赏性和经济价值也起着重要的作用。此外，β-胡萝卜素和含β-环的胡萝卜素是人类及动物体内维生素A(retinol)合成的前体(vanVliet等1996,vonLintig和Wyss2001)。许多其它非维生素A类胡萝卜素如叶黄体素(lutein)和玉米黄质(zeaxanthin)对人体也是非常有益的，它们具有抗癌和抗心血管疾病等作用(Landrum和Bone2001)。通过对参与类胡萝卜素生物合成基因的遗传操作可改良植物品质，如提高蔬菜(如番茄)和农作物种子(如水稻)中的β-胡萝卜素含量或改变植物花的颜色等。高等植物类胡萝卜素生物合成途径昀早是由Porter和Lincoln(1950)提出来的。由于类胡萝卜素生物合成酶主要位于膜上，量少，且在体外不稳定，类胡萝卜素生物合成酶的纯化颇为困难。然而，Armstrong等(1989)首次用功能互补法从一种光合细菌荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)中分离出类胡萝卜素生物合成基因。随后Misawa等(1990)从噬夏孢欧文氏菌(Erwiniauredovora)中也克61030卷植物生理与分子生物学学报隆到参与类胡萝卜素生物合成酶的基因。这些基因不仅可用于利用异源基因来克隆与高等植物类胡萝卜素生物合成途径中的其它基因，并可通过基因操作，在不具有类胡萝卜素生物合成途径的大肠杆菌中合成这些类胡萝卜素物质。迄今，应用反向遗传学技术(Bird等1991)、转座子标签法(Marin等1996)、异源基因作探针筛选基因组或cDNA文库(Romer等1993，Mann等1994，Ronen等1999)、图位基因克隆技术(Isaacson等2002，Park等2002)及其利用可合成各种类胡萝卜素的工程大肠杆菌作为酶的底物的“颜色互补”等技术(Cunningham等1996，Moehs等2001)，使得参与类胡萝卜素生物合成的基因都已从高等植物中分离出来。本文结合作者的工作，主要介绍近年来高等植物类胡萝卜素生物合成途径及其调控的分子生物学研究进展，以及利用类胡萝卜素生物合成基因在植物基因工程中所取得的成就和应用的前景。1　植物类胡萝卜素生物合成途径及其相关的酶与编码基因高等植物类胡萝卜素主要是在细胞的质体中合成的。在叶绿体中类胡萝卜素主要分布于镶嵌天线色素和光合反应中心复合体的光合膜上，而在成熟果实和花瓣的有色体中则主要积累在膜、油体(oilbody)或间质内的其它结构上。类胡萝卜素合成酶类是由细胞核基因编码的，编码翻译成蛋白质后转运至于质体中(Cunningham和Gantt1998)，从而参与类胡萝卜素的生物合成。1.1　类胡萝卜素的生物合成类胡萝卜素是由类异戊二烯聚合而成的萜类化合物，生物合成的前体是含有5个碳的异戊二烯焦磷酸(IPP)。绝大多数类胡萝卜素是由8个IPP单位聚合而成的含有40个碳的碳氢四萜类(胡萝卜素)及其含氧的衍生物。IPP在IPP异构酶(IPPI)作用下，异构化生成二甲基丙烯焦磷酸(DMAPP)。然后在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶(GGPS)催化下，DMAPP与3个IPP分子缩合而生成含有20个碳的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)(Kuntz等1992，Zhu等2002)。IPPI在植物体内可能是一个限速酶(Kajiwara等1997)。GGPP是类胡萝卜素生物合成的第一前体物质。由GGPP还可合成许多其它类异戊二烯聚合而成的化合物，如赤霉素(GA)、叶绿素中的植醇、生育酚及其它天然化合物(图1，Chappell1995)。类胡萝卜素生物合成的第一步是由八氢番茄红素合酶(PSY)催化两个GGPP分子聚合成具40个碳原子的八氢番茄红素(phytoene)。在番茄中有2个PSY基因，其中PSY1基因在果实和花中特异性表达，而PSY2基因则主要在叶片中表达(Bramley等1992；Fraser等1994，1999)。在黄花龙胆中至少也有2个PSY基因，PSY1基因在花中特异性表达(Zhu等2002)。在玉米中也有2个PSY基因(Palaisa等2003)。PSY是番茄果实、油菜种子、金盏草和黄花龙胆花等植物中类胡萝卜素生物合成中的一个限速酶(Bramley等1992，Fraser等1994，Moehs等2001，Shewmaker等1999，Zhu等2002)。因此，PSY是类胡萝卜素生物合成途径中的一个关键调节酶，其编码基因成为应用植物基因工程技术改善转基因植物中类胡萝卜素含量的首选目的基因。1.2　番茄红素(lycopene)的生物合成番茄红素是一种红色的类胡萝卜素，主要存在于番茄果实中，在其它水果和蔬菜中含量则很低。人们曾认为在植物体内由八氢番茄红素合成番茄红素是由八氢番茄红素脱氢酶(PDS)和ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)所催化的。此外，Isaacson等(2002)和Park等(2002)分别从番茄和拟南芥中分离和鉴定了类胡萝卜素异构酶(CRTISO)基因，并确认了在植物体内由八氢番茄红素转化番茄红素是PDS、ZDS和CRTISO三个酶共同作用的结果。这三个酶的催化产物分别是9,9'-二顺式-ζ-胡萝卜素(9,9'-di-cis-ζ-carotene)、7,9,7',9'-四顺式-番茄红素(7,9,7',9'-tetra-cis-lycopene)和全反式番茄红素(all-trans-lycopene)(Mann等1994，Albrecht等1995，Isaacson等2002，Park等2002，Zhu等2002)。然而，在细菌(如噬夏孢欧文氏菌)中的八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)可催化八氢番茄红素生成全反式番茄红素(Misawa等1990)。因此，在植物基因工程中，可以用一个细菌CrtI基因替代植物中的PDS、ZDS和CRTISO这三个基因，而且由于细菌中的CrtI基因编码的氨基酸序列与高等植物PDS基因编码的氨基酸序列仅有约30％的同源611朱长甫等:植物类胡萝卜素生物合成及其相关基因在基因工程中的应用6期图1　植物类胡萝卜素生物合成途径Fig.1　CarotenoidbiosynthesispathwayinplantsSummarizedbyauthorsbasingonCunninghamandGantt1998,2001;Isaacsonetal.2002;Parketal.2002;Zhuetal.2002,2003.61230卷植物生理与分子生物学学报性，所以可减少在转基因植物中经常出现的共抑制(co-suppression)现象。1.3　胡萝卜素的生物合成番茄红素环化是植物体内胡萝卜素生物合成途径的一个重要分枝点。植物体中存在番茄红素ε和β-两种环化酶(Cunningham等1996，Pecker等1996，Cunningham和Gantt1998，Ronen等1999，Zhu等2003)。番茄红素ε-环化酶(LYCE)只能催化番茄红素的一端形成δ-环，生成δ-胡萝卜素；而番茄红素β-环化酶(LYCB)可使对称性的番茄红素两个末端均形成β-环，生成β-胡萝卜素。δ-环和β-环的差异仅是环己烷环双键位置的不同(图1)。此外，番茄红素还可在LYCE催化下，生成δ-胡萝卜素，继而在LYCB催化下，在其另一个末端形成β-环，生成δ-胡萝卜素。β-胡萝卜素和含β-环的胡萝卜素(如α-胡萝卜素和β-隐黄质)是人类及动物体内维生素A生物合成的前体。在人体和动物体内，β-胡萝卜素中部可裂解生成两个分子的维生素A，而含有一个β-环的α-胡萝卜素和β-隐黄质的裂解只能产生一个分子的维生素A(vanVliet等1996，vonLintig和Wyss2001)。此外，在莴苣中还存在一种功能特殊的番茄红素ε-环化酶(Cunningham和Gantt2001)。尽管莴苣ε-环化酶的氨基酸序列与拟南芥ε-环化酶的氨基酸序列有77％的同源性，但前者具有催化在对称性的番茄红素两个末端均形成δ-环的功能，而