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实验室保存BCPAP细胞基本资料BCPAP人甲状腺癌乳头状细胞细胞背景资料(源自ATCC)ATCC中没有本细胞株,该细胞购自广州吉尼欧生物科技有限公司;细胞来源:法国UniversityofMedecineLyon-Sud细胞图片Lowdensity(40fold)Highdensity(40fold)培养方法培养基:RPMI-1640+10%FBS,青霉素100IU/mL和链霉素100μg/mL培养箱条件:37℃,5%CO2复苏:从液氮中取出细胞,迅速放入37℃水浴(注意防止冻存管炸裂),待解冻后迅速加入9ml完全培养基中混匀,离心(800rpm,3min),将收集的细胞用3ml完全培养基重悬,转入细胞培养瓶培养。换液:弃去旧培养基,加入3~4ml预热37℃的新鲜培养基。1~2天换液一次,视细胞密度和培养基变色的程度而定。传代:当细胞生长至80%时应当传代。弃去培养基,用PBS或无血清培养基冲洗1~2次,加入1ml胰酶(25cm2培养瓶)铺平,37℃消化直至细胞大部分脱离瓶底(1-2min左右),加入2ml完全培养基终止消化,转入15ml离心管中,离心(800rpm,3min)去上清,加入完全培养基重悬细胞,轻轻打散后分装至细胞培养瓶培养(按1:2的比例传代)。注:进口细胞培养瓶可重复使用,但每次胰酶消化后,要用PBS将瓶壁冲洗2遍后再接入细胞。冻存:取处于对数生长期、生长状态良好的细胞,用胰酶消化后加完全培养基终止消化反应,离心(900rpm,3min)去上清(操作同传代),轻轻敲散后用细胞冻存液重悬细胞(1×106~5×106细胞/ml),分装至冻存管(1ml/管),放入梯度降温盒后置于-80℃冰箱,24小时后放入液氮中保存。注:为保证细胞的状态良好,冻存前24h应换液。细胞生长曲线(CCK-8测定)注:30min处为加入CCK-8后30min测定数据,60min处为加入CCK-860min后测定数据00.20.40.60.811.21.41.60200040006000800010000BCPAP30min0h24h48h72h种板密度(细胞/每孔)吸光度(OD450-OD620)00.511.522.50200040006000800010000BCPAP60min0h24h48h72h种板密度(细胞/每孔)吸光度(OD450-OD620)合适种板密度4000细胞/孔(96孔板,增殖抑制试验)状态判断目前该细胞生长状态良好,适合做药筛实验附:生长曲线绘制方法1取对数期生长状态良好的细胞,胰酶消化后,吹打成单细胞悬液,接种于96孔培养板;设计8个浓度梯度,分别为2x103、3x103、4x103、5x103、6x103、7x103、8x103、9x103细胞/孔,每孔培养基100微升,每个浓度三个重复,同样的浓度种四块板,37℃、5%CO2培养箱中培养过夜;2接种12h后待细胞完全贴壁后弃去原培养基,此时记为0h,CCK-8法测板一块,其余3板每孔加入200微升完全培养基继续培养00.20.40.60.811.21.40244872BCPAP30min20003000400050006000700080009000时间(h)吸光度(OD450-OD620)00.511.522.50244872BCPAP60min20003000400050006000700080009000吸光度(OD450-OD620)时间(h)3CCK-8法:加入CCK-8液(10微升/孔);继续培养1小时;分别于30min和60min各测板一次4酶标仪检测各孔OD值(检测波长450nm,参比波长620nm);记录结果;5剩余3板分别于24h,48h,72h处测板,测板方法同上BCPAP细胞增殖抑制预实验结果96孔板药物浓度布局PBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSBlankDMSOT100T10T1T0.1T0.01PBSPBSBlankDMSOT100T10T1T0.1T0.01PBSPBSBlankDMSOT100T10T1T0.1T0.01PBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBS细胞密度:4000cell/well;T:紫杉醇Taxol(ng/ml);加药72h后测板原始数据OD450PBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBS1.6111.5760.4780.5691.231.4751.418PBSPBS1.5771.6010.4940.5851.1171.4081.546PBSPBS1.6081.5950.4450.5731.1571.3911.395PBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBS加药72h后测板原始数据OD620PBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBS0.0580.0530.0430.0460.0520.0540.053PBSPBS0.0540.0540.0450.0460.050.0520.054PBSPBS0.0570.0540.0450.0470.050.0520.052PBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSPBSOD450为细胞与测试试剂反应产物的吸光值,OD620为溶液浊度的值,因此各孔的实际OD值=OD450-OD620各药物浓度对BCPAP细胞增殖的抑制率Taxol(ng/ml)Inhibitionrat(%)IC5010072.153558.589ng/ml1065.56062127.304270.110.73520.018.913468抑制率计算:Inhibitionrate(%)=(ODDMSO对照组-OD药物处理组)/ODDMSO对照组×100IC50计算(SPSS):在变量表中定义变量名为“剂量”、“抑制率”、“总值”,在数据表中依次输入各变量的值,“总值”多设为100%。点击“Analysis—regression—probit”,将“剂量”选入“协变量”栏,“抑制率”选入“响应频率”栏,“总值”选入“观测值汇总”栏中,在“转换”栏中选择“对数底为10”,在“模型”栏中选择“Probit”概率单位模型,在“选项”栏中选择“从数据中计算”,其他保持默认选项,然后单击“OK”。效应概率水平为0.50时的剂量值即为IC50。
本文标题:BCPAP基本资料new
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