Caco2与口服药物的吸收

Caco-2与口服药物的吸收目录肠上皮细胞及Caco-2细胞简介体外Caco-2细胞及体内肠细胞的药物转运Caco-2在研究口服药物吸收中的应用肠上皮细胞及Caco-2细胞简介肠道的解剖生理（小肠为例）小肠由浆膜层、肌层、黏膜下层和黏膜组成。小肠黏膜分为3层：1.黏膜肌层2.固有层：主要由结缔组织组成。3.上皮：由单层柱状上皮细胞（肠上皮细胞）组成，覆盖于隐窝和绒毛表面。覆盖小肠绒毛上皮的细胞：吸收性细胞或肠上皮细胞，是高柱状细胞杯状细胞：分泌黏液，与肠上皮细胞比，更耐受高渗透压。内分泌细胞：产生激素和肽类，如促胃液素等。丛细胞小肠内的消化小肠内的营养物质和水通过肠粘膜上皮细胞，最后进入血液和淋巴的过程中，必须通过肠上皮细胞的腔面膜和底膜（或侧膜）。物质通过这些膜的机制，即吸收机制，包括简自由扩散、协助扩散、主动运输、胞吐和胞吞等。跨细胞途径药物跨过肠上皮细胞的途径：①、被动细胞转运②、胞旁转运③、载体介导转运④、胞饮作用细胞模型运用的意义药物研究和新药开发在借助高通量筛选方法确定具有预期药理作用性质的化合物之后，往往需要进行基于细胞平台的、可预测先导化合物的组织通透性测定研究。基于细胞平台的研究方法可用来确认具有理想的组织通透性的化合物，随后可采用动物模型进行最终筛选。这一方法不仅具有最佳的成本-效能比，而且能够达到最少使用动物资源的目的。肠上皮细胞模型为了有效评估药物的肠转运，细胞株必须分化成极化单层细胞膜，而且保持人类肠细胞的形态特征。人类肠细胞的原代培养细胞活性低，且不能分化形成单层细胞膜。经过研究，已经能培养出无线增殖的细胞，其中由人结肠癌得到的Caco-2细胞株是应用最广泛的模型。肠上皮细胞模型1974年，人们分离得到Caco-2细胞株。Caco-2细胞株的生长包括增殖、融合和分化阶段。在半透膜上生长分化的Caco-2细胞与正常肠细胞具有非常相似的形态特征。即紧密连接、顶侧基面、基地侧面和刷状缘。Caco-2细胞的特点Caco-2细胞来源于人的结肠癌，结构和功能类似于人小肠上皮细胞，并含有与小肠刷状缘上相关的酶系。在细胞培养条件下，细胞可融合并分化为肠上皮细胞，形成连续的单层，这与正常的成熟小肠上皮细胞在体外培育过程中出现反分化的情况不同。Caco-2细胞与人小肠上皮细胞在形态学上相似，具有相同的细胞极性和紧密连接，这些性质可以恒定维持约20天。由于Caco-2细胞性质类似小肠上皮细胞，因此可以在这段时间进行药物的跨膜转运实验。Caco-2细胞模型Caco-2细胞模型是一种药物离体口服特性筛选模型，已广泛用于药物在小肠吸收的评价和各种转运机制研究中。特别是在药剂学研究注重在分子水平和细胞水平上发展的今天，Caco－2细胞模型可应用于多类药物研究，帮助了解药物的吸收机制，预测体内吸收和药物相互作用，研究药物的小肠代谢情况，从而促进新药研发。Caco-2细胞模型的发展1、Fogh等人在1974年首次分离出了Coca-2细胞。2、1989年Borchardt等人将其应用于小肠吸收并作了大量研究。Caco-2类似细胞模型发展迅猛的主要原因较差的药物动力学性质如药物吸收不充分，是临床研究阶段中候选新药研究失败的主要原因药物通过生物屏障的吸收是一个相当复杂、涉及整个途径的过程，因此无法轻易地借助于整体实验动物进行解释分析在药物开发发现阶段中引进组合化学方法所获得的化合物数量巨大，传统动物吸收模型不能适应繁重的研究工作要求Caco-2模型现存的优缺点优点：Caco-2模型是FDA认可的对药物进行吸收研究的两种模型之一（另一种为MDCK）。其特殊性在于，实验装置中的小肠上皮细胞顶侧基面和地侧基面两侧具有实验操作的可接近性或可到达性，这是其成为研究药物转运、外排的极佳模型。仅需极微量化合物（约1mg）即可进行药物转运实验。缺点：虽然Caco-2细胞株极易生长，且形成极化的单层细胞膜，但这种单层细胞膜还是不同于人肠屏障。培养过程中无杯状细胞，故顶层基面并无粘液层，而人们通常认为肠黏膜黏液可能是药物吸收的另一道屏障。这使得研究时可能会人为高估某些药物渗透系数。Caco-2细胞株生化特征和形态特征类似于肠细胞，但并不完全一致。Caco-2模型现存的优缺点体外Caco-2细胞及体内肠细胞的药物转运药物跨肠上皮细胞转运途径被动扩散细胞旁路转运载体转运胞饮和吞噬作用被动扩散90％以上的药物脂溶性好，油水分布系数大，易分布于上皮细胞脂质膜，且小肠上皮细胞的刷状缘膜表面积约为旁路转运吸收面积的1000倍。细胞旁路转运1.常常难以快速地分布到小肠刷状缘膜上2.细胞旁间隙仅占肠管表面积0.01%~0.1%3.部分经细胞转运途径被吸4.细胞间的紧密连接针对吸收速度慢且不完全的药物载体转运1.一元羧酸转运蛋白（MCT）介导的主动转运2.pH依赖的特异转运载体介导的主动转运3.其他转运载体介导的主动转运某些与营养物质化学结构相似的药物1.这类药物的转运通过被动扩散和载体介导共同完成。2.肠上皮细胞上还存在外排载体如P糖蛋白。载体转运胞饮和吞噬作用胞饮和吞噬作用在药物吸收中的作用相对较小,主要是一些肽类抗原物质的转运方式,因为分子体积大通常不被其他途径转运。缺点就是转运部位存在大量的蛋白水解酶,使得许多外源性蛋白在转运过程中水解。实验证明,被动扩散药物在Caco-2细胞上的转运吸收与体内吸收差异较小。与小肠上皮结构相比较,Caco-2细胞层是平面结构,而小肠褶皱及微绒毛结构使得体内吸收面积剧增,因此推测只有部分吸收面积参与了快速被动扩散药物的转运。Caco-2细胞及体内肠细胞的比较对于吸收慢且不完全的药物,体内吸收速率约为Caco-2体外模型吸收速率的30~80倍,原因有:1.药物的体内和体外细胞旁路渗透系数的差异；2.体内和体外实际吸收面积的差异。Caco-2细胞及体内肠细胞的比较药物的吸收转运机制研究Caco-2细胞模型可以同时测定药物的双向转运通过参数计算确定药物的吸收转运机制。1.若在整个浓度范围内(于漏槽条件下)的Papp值恒定,则被动扩散为主;2.若PCaco-2(B→A)与PCaco-2(A→B)相同,则也可确定被动扩散为主;3.若PCaco-2(B→A)/PCaco-2(A→B)1.5,则提示可能存在主动转运机制;4.P糖蛋白和多药耐药相关蛋白是Caco-2细胞上2种主要的转运蛋白,发挥外排泵的作用,能将细胞内物逆浓度梯度转运至细胞外Caco-2在研究口服药物吸收中的应用Caco-2在研究口服药物吸收中的应用（1）药物制剂处方组成透膜性和黏膜毒性的评价（2）药物吸收过程中相互作用的预测（3）药物的化学结构和体内转运间关系的研究（4）药物肠吸收限速因素的揭示（5）药物代谢稳定性的估计（6）肠腔pH值对药物吸收影响的评价一、药物制剂处方组成透膜性和黏膜毒性的评价1、药物经Caco-2细胞单层转运过程中测定TEER值：检查细胞单层的完整性测定Papp值：考察其透膜性2、当药物影响细胞单层的完整性时跨膜电阻值的下降揭示上皮细胞黏膜毒性一、药物制剂处方组成透膜性和黏膜毒性的评价3、制剂处方中的辅料用于影响制剂物料的性能改善药物制剂质量判断辅料对小肠上皮完整性产生的影响由于Caco-2细胞模型与小肠上皮细胞类似,评价方式如下：（1）考察各种处方组成对于药物转运的影响：Papp值的大小（2）评价处方组成对上皮细胞黏膜的安全性：表现为跨膜电阻值和转运漏出标志物（如甘露醇）Papp值的变化当跨膜电阻值下降而Papp值上升时,可以证实处方对Caco-2细胞完整性有不利作用。当药物从细胞模型上移走后,以跨膜电阻TEER作为时间t的函数,可以判断此作用是否可逆。一、药物制剂处方组成透膜性和黏膜毒性的评价1、载体介导的主动转运的药物其吸收过程中载体的饱和显著地影响药物的生物利用度2、联合用药时增加了药物之间互相竞争酶、载体或外排泵的可能性导致单独给药与联合用药时生物利用度出现较大差异二、药物吸收过程中相互作用的预测1、这种与药物吸收有关的相互作用，可以在Caco-2细胞模型中进行研究和估计2、与药物吸收有关的相互作用来源：特定药物重复给药后对代谢酶、载体、外排泵等的诱导作用当药物通过经细胞转运途径吸收时外排载体(如P糖蛋白)成为药物吸收的一个重要生化屏障将进入细胞内的药物外排从而减少了药物的吸收二、药物吸收过程中相互作用的预测成为口服药物生物利用度低、个体差异大的一个重要因素PS.具有这种P糖蛋白底物性质的药物分子在与P糖蛋白抑制剂合用时,其透过细胞膜吸收的程度将增强(表示为Papp值的增大)。例子：（1）维拉帕米和红霉素等：通过抑制P糖蛋白提高非索非那定、他林洛尔和地高辛的吸收度。（2）这类药物分子与P糖蛋白诱导剂合用时,其吸收程度将有不同程度的降低,。（3）利福平对P糖蛋白的诱导作用则显著降低了他林洛尔及地高辛的吸收。二、药物吸收过程中相互作用的预测结论：Caco-2细胞中存在与小肠上皮细胞相同的各种运动系统、代谢酶,因此可以作为研究药物相互作用的体外模型。例子：（1）一系列用于减肥的1,5苯二氮类化合物(CCKA受体激动剂),其化学结构和吸收转运间(表现渗透系数Papp)具有较强的相关性:（式中n为氢链数目,S为表面积,E为溶剂化能。）（2）有实验证明,增加药物亲脂性可较大幅度的提高母体药物的膜通透性。三、药物的化学结构和体内转运间关系的研究结论：1.化学结构对小肠吸收的影响,可大大促进有效口服药物的发现。2.应用化学结构方面的信息(如油水分配系数、氢键数、偶极矩和分子表面积等),可以提高药物命中率,合成具有较好生物利用度的药物。三、药物的化学结构和体内转运间关系的研究通常,当不溶性或难溶性药物吸收困难时,如何增加药物溶解性是处方设计中必须解决的问题,但是在这之前,阐明药物本身是否具有良好的转运能力非常重要。四、药物肠吸收限速因素的揭示Caco-2细胞模型应用优点：1.有效地揭示药物吸收转运的限速过程是药物的溶解性还是膜通透性。2.通过不同浓度范围的Papp值变化来考察吸收的限速过程,进而采取相应措施。原因：在小肠上皮细胞的刷状缘膜上发现的酶(如氨基肽酶、碱性磷酸酶、二肽氨基肽酶等)在Caco-2细胞中均存在。Caco-2细胞含有许多小肠上皮细胞中包含的酶因此可用于评价转运过程中药物的代谢稳定性。五、药物代谢稳定性的估计例子：有证据表明微粒体细胞色素P450同工酶存在于Caco-2细胞中,这些同工酶类似人小肠细胞中的CYP3A。五、药物代谢稳定性的估计结论：Caco-2细胞是研究药物分子经小肠上皮吸收首过代谢的有效模型传统体外模型：离子化的药物分子只有很窄的吸收范围,并且只在胃肠道的特定部位吸收(此时非离子型占重要部分)传统体外模型缺点：难以决定药物的弱吸收是由于离子化还是其本身固有的弱转运性或二者同时引起。六、肠腔pH值对药物吸收影响的评价采用Caco-2细胞模型Caco-2细胞模型的优点：1.可以评价不同pH值下离子化程度与药物跨膜转运的关系,从而了解弱收原因。2.Caco-2细胞模型提供了吸收机制的细节,是解决与转运相关的低生物利用度问题的有效工具。六、肠腔pH值对药物吸收影响的评价Caco-2细胞来源于人体,不会造成上皮细胞的形态学和生理学性质上的种属差异,也不会像许多其他的体外肠吸收模型一样要求使用实验动物。用Caco-2细胞模型可详尽地研究药物从AP端跨过上皮细胞、摄取、代谢到BL端的排放等细节,对于研究药物的小肠吸收机制有重要意义。结语2015-11-11