水稻根际土壤及根组织内外固氮微生物的遗传多样性分析

农业生物技术学报JournalofAgriculturalBiotechnology2007,15(5):841~846 *基金项目：福建省科技项目（No.2001Z026）资助。*通讯作者。Authorforcorrespondence.研究员，主要从事分子微生物和生物固氮研究。E­mail：[e-mail].收稿日期：2007­02­06接受日期：2007­05­26·研究论文·水稻根际土壤及根组织内外固氮微生物的遗传多样性分析* 陈彬, 郑斯平,周莉娟, 林智敏, 宋亚娜, 郑伟文 **（福建省农业科学院生物技术研究所，福建350003）摘要：利用PCR­RFLP检测水稻（）根际土壤及根组织内外固氮微生物的基因，对54个阳性克隆的限制性内切酶玉和芋的RFLP图谱联合进行UPGMA聚类分析。结果表明，8对相似的带型(相似性50%)和2对同源性为100%的带型分别来源于水稻根际土壤及根组织内外，3种特有的带型均来源水稻根际土壤和3种特有带型来源于水稻根组织内外。证明水稻根际土壤和水稻根组织的固氮微生物具有显著的多样性，也初步显示了土壤中某些固氮微生物能定植于水稻根内或根表。关键词： ;PCR;RFLP；水稻；根际土壤中图分类号: S188 文献标识码:A 文章编号:1006­1304(2007)05­0841­06 GeneticDiversityAnalysisofDiazotrophsinRhizosphericSoilandon/inRiceRoot CHENBin,ZHENGSi­ping, ZHOULi­juan,LINZhi­min,SONGYa­na, ZHENGWei­wen** ( , , , ) Thegeneticdiversityofthedinitrogen­fixingbacteriaassociatedwithrice( )wasassessedbyaPCR­RFLP approachonthe genedirectlyamplifiedfromDNAextractedfromwashedricerootsandrhizosphericsoil.Restrictiondigestion withenzymes玉and芋 wasperformedtocharacterize54cloned PCRproducts.RFLPprofileswereclusteredandana­ lyzedwithUPGMAprogram.EightpairsofsimilarRFLPpatterns(similarity50%)obtainedfromrhizosphericsoilandtwopairof homologicalRFLPpatterns(100%identity)generatedfromtherootswerefoundrespectively.Threespecificdiazotrophicpatternsob­ tainedfrombothrhizosphericsoilandthericerootswerefoundindividually.Theanalysesdocumentthepresenceofdifferent types,whichappeartobeavarietyofsignificantcomponentsofthediazotrophiccommunityinpaddyfield,indicatingsomeofthedia­ zotrophscancolonizewithinriceroottissueoronthesurfaceoftheroots. ;PCR;RFLP；rice;rhizosphericsoil许多重要的作物例如水稻,小麦,玉米，甘蔗等在自然土壤中无人为接种的情况下，能借助生物固氮取得其生长对氮的需求（Boddey,1995;Stefan .,2005）。近年来还发现一些内生菌能定植在水稻和牧草的根部(Hurek .,1994;Engelhard , 2000)，在它们的通气组织内也存在固氮微生物(Hurek .,1997;Egener .,1999;Jamas ., 2002)。从这些植物根部组织内分离出的固氮微生物经过培养后可达到很高的数量级（每克根干重达到108个细菌）(McClung .,1983；Reinhold ., 1986；Barraquio ,1997)。研究还发现大部分淹水作物中的固氮微生物只能定植在根部，并不能在植物细胞内形成内共生（JamesandOlivares,1998; ReinholdandHurek,1998），而且这种相互作用的群体是动态的。了解和掌握土壤和作物根际微生物群落的多样性变化和活动机制，是科学利用固氮资源，减少化学氮施用量的必要前提。对土壤微生态系统中微生物群落多样性的研究，传统的方法是基本局限于从固体培养基上分离微生物，然后进行生物化学性状，或者特定的表型分析。随着对生物研究的不断深化，人们发现传统实验室培养法只能培养大约1%的土壤微生物，因此很难全面地评价微生物群落多样性。上世纪90年代以来，建立和发展起一套分子生物学前沿的研究方法，农业生物技术学报2007年如测序、变性梯度凝胶电泳（DGGE）(Lovell , 2000)、限制性片段长度多态性（RFLP）（Poly ., 2001）和荧光末端标记的限制性片段长度多态性（T­RFLP）(Moeseneder ,2001,Tan ,2003)均可在很大程度上克服传统方法的不足。所有固氮微生物中都含有编码铁蛋白的基因。Young .(1992)研究发现，基因的系统发育树与rRNA具有显著的一致性。基因的DNA和RNA片段的分子生物学分析则提供了一个比传统方法分析更为灵敏和准确的固氮微生物群落分布图。现已发现了大量新的基因片段，其中大多数来源于不可培养的固氮微生物(Ueda .,1995; Engelhard ,2000;Hurek .,2002;张于光等，2005)。Tieying .(2005）用16SrDNA­PCR­DGGE技术已经证明了福建稻田土壤中蓝细菌的遗传多样性。随后的研究已初步揭示福建省永泰县无施肥稻田土壤中固氮微生物多样性高于施肥的土壤，且有较高的固氮活性，对水稻生长有促进作用(Lotta, 2005)。本实验是该研究的延续，旨在利用PCR­RFLP揭示在不施氮肥的条件下，水稻根际土壤和水稻根组织内外固氮微生物的多样性。1材料和方法1.1样品本实验的样品取自福建省永泰县未施氮肥的稻田。实验的样品分为两类，一类是水稻（）根际土壤（0~5cm深度），此类样品记为RH，所采集样品迅速置于液氮中保存。另一类样品是将水稻根系的土壤先用自来水冲洗干净，再用无菌水漂洗3遍并迅速保存于液氮，此类样品记为RW。1.2核酸的提取与纯化根据Hurt .(2001)方法提取所有样品的总核酸，使用QIAGENRNA/DNA分离试剂合（Ger­ many）分离和纯化样品DNA。1.3基因片段的PCR扩增及PCR产物的浓缩选择引物PolF(5'­TGCGAYCCSAARGCB­ GACTC­3')和PolR(5'­ATSGCCATCATYTCPCCG­ GA­3')扩增长度为361bp的基因片段，引物来自基因的编码序列（GeneBank登入号M20568)。25滋 L反应体系中含有1倍的PCR缓冲液，1倍Q­solution，200滋 mol/L dNTP,各16.5滋 mol/L引物,0.5U DNA聚合酶(Qiagen,Hilden,Germany)和9ng的DNA模板。PCR的反应程序为：95 ℃预变性14min，接着94 ℃变性1min,55 ℃退火1min，72 ℃延伸1min，重复30个循环，最后72 ℃延伸10min。等体积的无水乙醇与PCR产物(RH和RW)混合,涡旋震荡5s,在室温下放置15min,4 ℃下13000r/min离心20 min。沉淀中加入70%的乙醇,13000r/min离心10 min。小心地除去上清后,凉干,用5滋 L水溶解沉淀,用于克隆的连接反应。1.4克隆文库的建立及筛选按照TOPO克隆试剂合(Initrogen)说明书，按以下方法建立连接反应体系:5滋 L新鲜的PCR产物, 1滋 L盐溶液,1滋 LTOPO质粒。每个样品取100和200滋 L的转化细胞液涂布于预热的含有50滋 g/ mL氨苄青霉素的平板。24h后从各自的克隆文库中随机挑取30个单菌落,直接作为PCR模板,采用1.3相同的PCR反应体系筛选阳性的克隆。1.5RFLP分析将阳性克隆菌落PCR产物采用1.3的方法浓缩后，按如下反应体系进行酶切：25滋 L的反应体系中含有5滋 L浓缩后的PCR产物，1倍的反应缓冲液，终浓度为100滋 g/mL的BSA，以及2U的限制性内切酶(玉、芋和玉)。酶切反应在37℃过夜。酶切产物用3%MetaPhor琼脂糖分离，用BioRadFingerprinting域软件分析酶切图谱。2结果2.1基因的PCR扩增及克隆来源于水稻根际土壤和水稻根组织的DNA通过PCR扩增，得到长度为361bp的基因片段（图1），结果显示固氮微生物不仅存在于水稻根际图1.基因扩增的PCR图谱Fig.1.PCRamplificationfromDNAwith primer PolF/PolR 1,阴性对照;2和3,水稻根际土壤(RH)；4和5，水稻根组织(RW)；M,100bpDNA分子标记。1,negativecontrol；2and3,rhizospheresoil(RH);4and5，washedroot (RW)；M,100bpmarker. 842第5期陈彬等:水稻根际土壤及根组织内外固氮微生物的遗传多样性分析土壤中，而且也附着或定植于水稻根表或根组织内。第1次实验建立了水稻根际土壤和水稻根表或根内固氮微生物基因的克隆文库，仅筛选到几个阳性的克隆菌落。为了增加克隆效率，用无水乙醇浓缩法浓缩目的片段，使效率提高到90%以上，其中从水稻根际土壤选出28个阳性单菌落（挑选总数30个），从水稻根组织克隆文库中挑出26个阳性菌落（挑选总数30个）。2.2基因片段的RFLP分析选用3种不同的限制性内切酶(玉、芋和玉)，其中图2和3显示了两种不同的酶切图谱，表明水稻根际土壤和水稻根组织中固氮微生物图2.限制性内切酶玉的RFLP酶切图谱Fig.2.Profilesof PCRproductsdigestedbyrestrictionenzyme玉 A.来源于水稻根组织的1~26克隆文库(RW);B.来源于水稻根际土壤1~28克隆文库(RH);M,DNA分子标记。A.1~26,clonesfromthewashedroots(RW)library；B.1~28,clonesfromtherhizospheresoil(RH)library;M，molecularweightDNAladder.图3.限制性内切酶芋的RFLP酶切图谱Fig.3.Profilesof PCRproductsdigestedbyrestrictionenzyme芋 A.来源于水稻根组织的1~26克隆文库(RW);B.来源于水稻根际土壤1~28克隆文库(RH);M,DNA分子标记。A.1~26,clonesfromthewashedroots(RW)library；B.1~28,clonesfromtherhizospheresoil(RH)library;M，molecularweightDNAladder. 843农业生物技术学报2007年存在多样性，其中限制性内切酶玉的酶切图谱展现的多样性最高（图2）。根据酶切图谱的泳道将来自于水稻根组织的样品标记为RW1，RW2…，以此类推；将来源于水稻根际土壤的样品标记为RH1，RH2…，以此类推。应用BioRadFingerprinting域软件对玉的酶切图谱（图2）与芋的酶切图谱（图3