Caspase3活性检测试剂盒(比色法)

北京吉美生物技术有限公司Caspase3活性检测试剂盒(比色法)产品简介：Caspase(Cysteine-requiringAspartateProtease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1~11等,均属于蛋白酶家族。Caspase3又称CPP32、Yama、apopain、Caspase-3，属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase3可以剪切procaspase2、6、7和9，可直接特异性剪切许多Caspase底物（如PARP、ICAD等），并在细胞核凋亡过程中起到重要作用。JimeiCaspase3活性检测试剂盒（比色法）(Caspase3ColorimetricAssayKit)的检测原理是利用Caspase3催化底物acetyl-Asp-Glu-Val-Aspp-nitroanilide(Ac-DEVD-pNA)产生黄色的游离硝基笨胺pNA(p-nitroaniline)，通过测定分光光度比色法测定pNA在400~410nm处吸光值，从而间接获得Caspase3的活性。产品组成：自备材料：1、水浴锅或恒温箱2、96孔板3、酶标仪或分光光度操作步骤（仅供参考）：1、制备标准曲线：①按照CaspaseLysisbuffer：Assaybuffer=1：9的比例配制适量的标准品稀释液。②用标准品稀释液稀释pNA(10mM)，使pNA分别达到200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM，另外设置一般不加pNA仅含标准品稀释液作为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。③取pNA浓度分别为200μM、100μM、50μM、25μM、12.5μM、6.25μM、0的标准品各100μl加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl的比色杯，测定405nm处吸光值即A405。④用每一个标准品的A405减去不含pNA的空白对照的A405，计算出实际的吸光值。以每个浓度的标准品A405为x轴，以对应的pNA浓度为y轴，用Excel制作pNA浓度对A405值的标准曲线。2、样品裂解：①悬浮细胞：取实验样品和对照样品，1000g4。C离心5min收集细胞，小心吸除编号名称JC221650TJC2217100Tstorage试剂（A）：CaspaseLysisbuffer10ml20ml4。C试剂（B）：Assaybuffer10ml20ml4。C试剂（C）：Ac-DEVD-pNA(2mM)0.25ml×20.25ml×4-20。C避光试剂（D）：pNA(10mM)0.25ml×20.25ml×4-20。C避光使用说明书1份北京吉美生物技术有限公司上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。按每2~10×106细胞加入100μlCaspaseLysisbuffer的比例加入CaspaseLysisbuffer，重悬细胞沉淀，冰浴裂解15min。②贴壁细胞：弃细胞培养液，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集至细胞培养液，1000g4。C离心5min，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。按照每2~10×106细胞加入100μlCaspaseLysisbuffer的比例加入CaspaseLysisbuffer，重悬细胞沉淀，冰浴裂解15min。③组织样品：按每3~10mg组织加入100μlCaspaseLysisbuffer的比例加入CaspaseLysisbuffer，冰浴上用玻璃匀浆器匀浆并转移至1.5ml离心管中，冰浴裂解5~10min。④4。C12000g离心10~15min，取上清至新的1.5ml离心管。立即测定Caspase3的酶活性或者-70。C保存样品。⑤蛋白定量：由于CaspaseLysisbuffer含还原剂不宜采用BCA法，可采用Bradford法测定蛋白浓度。以蛋白浓度达到1~3mg/ml为佳，否则应增加细胞或组织的量。3、样品检测：①按照下表设置96孔板反应体系，溶液应按照顺序依次加入，即Assaybuffer→待测样品→Ac-DEVD-pNA(2mM)。同时应设置不加待测样品的反应孔作为空白对照。酶活性过低或过高，可增加或减少待测样品的用量，大多数情况下，每个反应体系加入10~15μl待测样品即可，并注意避免产生气泡。空白对照高酶活性样品低酶活性样品Assaybuffer90μl85μl65μl待测样品0μl5μl25μlAc-DEVD-pNA(2mM)10μl10μl10μl总体积100μl100μl100μl②孵育：盖紧96孔板，37。C孵育60~120min。肉眼可见颜色发生变化时，即可进行A405检测；如果颜色变化不明显，可适当延长孵育时间甚至过夜。③待测样品A405分别减去空白对照A405即为样品Caspase3水解底物产生的pNA吸光值，根据标准曲线即可获得酶的含量。④用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度（由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不适合采用BCA法进行蛋白浓度测定），进而计算出一个样品单位重量蛋白中所含的Caspase3的酶活力单位即Caspase3酶活力单位/mgprotein.计算结果：①Caspase3酶活力单位的定义：Oneunitistheamountofenzymethatwillcleave1.0nmolofthecolorimetricsubstrateAc-DEVD-pNAperhourat37。Cundersaturatedsubstrateconcentrations,即当底物饱和时，在37。C一个小时内可以剪切1nmolAc-DEVD-pNA产生1nmolpNA的Caspase3的酶量。根据pNA标准曲线和样品A405值，可计算出Caspase3酶活力单位。说明：底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37。C孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中Caspase3酶活力特别高的情况，须用CaspaseLysisbuffer适当稀释样品后再进行测定。②Caspase3酶活性的另外一种表示方法是Caspase活性增加的百分比即实验处理组A405/实验对照组A405×100%，简单而可靠，可粗略的反应酶活性情况。北京吉美生物技术有限公司注意事项：1、建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。2、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检测体积，尽量采用100μl体积以内的比色环。3、所测样品的值高于标准曲线的上限，应用裂解液稀释样品后重新测定。4、样品蛋白有效含量过低或Caspase激活水平过低都会导致实际测得的A405过低，应注意使蛋白浓度尽量达到1~3μg/ml，调整诱导凋亡的时间和条件。5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。有效期：12个月有效。相关产品：产品编号产品名称JC2008磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)JD3016Masson三色染色液JN5145DEPC处理水(0.1%)JP7169丽春红S染色液(1×PonceauS)