Bmi-1质粒载体的构建

Bmi-1基因过表达载体的构建【摘要】目的：在真核细胞中构建Bmi-1基因的过表达载体。方法：从GenBank中获取Bmi-1基因序列，设计针对Bmi-1的特异性引物，利用PCR方法获得全长目的基因，将目的载体和PCR产物进行双酶切，在T4DNA连接酶下形成重组质粒。对长出的克隆先进行菌落PCR鉴定，再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的即为构建成功的目的质粒。结果：经阳性克隆测序结果及结果分析，测序正确。结论：人源Bmi-1真核过表达载体构建成功。【关键词】Bmi-1；过表达载体；转化前言：多梳基因(polycombgroupgenes,PcG)家族是果蝇发育时维持同源异形基因稳定表现的重要因子。在胚胎发育、肿瘤发生和干细胞的维持中有着重要的作用。由荷兰癌症中心于1991年在鼠淋巴瘤中发现的Bmi-1基因(Bcell-specificMLVinte-grationsite-1)是多梳基因家族中重要成员之一,参与干细胞的增殖、分化与衰老,在多种肿瘤形成过程中起重要作用[1]。人类Bmi-1基因克隆和定位在10号染色体短臂13区(该区域被认为与各种白血病染色体易位有关),DNA大小为4.9kb,mRNA为3199bp,含10个外显子,编码含326个氨基酸的蛋白质,分子质量为36.9kD[2]。其蛋白表达在细胞质、染色质或染色体。Alkema等用鼠Bmi-1cDNA片断作为探针从人白血病细胞中分离出Bmi-1并进行分析,发现其核苷酸序列与鼠的一致性达86%,所编码的蛋白质的氨基酸系列与鼠的一致性达98%。Bmi-1基因含有一个环指模序,位于N-末端的环指结构域(ringfin-gerdomain,RF),与抑癌基因c-Myc协同在细胞增殖和肿瘤形成中发挥作用。Bmi-1通过环指结构与其他环指蛋白,如dinG等形成异源二聚体,再与其他成分相互结合,抑制其靶基因的转录[3]。Bmi-1基因还含有一个位于中心的保守DNA结合模序螺旋-转角-螺旋-转角(DNAbandinghel-ix-turn-helix-turnmotif,H-T-H-T),起转录抑制作用。研究表明,这两个结构在细胞生存期的延长和抑制p16上是不可或缺的,敲除这两个结构,Bmi-1基因即会失活,导致早衰。1材料与方法1.1实验材料和主要试剂试剂1kpDNAladderMarker来源于Fermentas公司；250bpDNAladderMarker来源于捷瑞公司；琼脂糖来源于赛百盛公司；限制性内切酶来源于NEB公司；In-Fusion™PCRCloningKit来源于clontech公司；Taqpolymerase来源于SinoBio公司；dNTP来源于Takara公司；Primer来源于捷瑞生物公司；Plasmid抽提Kit来源于Promega公司。1.2过表达载体构建以元件顺序为CMV-EGFP-MCS-SV40-Neomycin的GV144载体酶切，其克隆位点为：XhoI/BamHI。1.3目的基因片段的获取用序列为TCCGCTCGAGCTATGCATCGAACAACGAGAATC的引物BMI1(5154-2)-P1和序列为ATCGGGATCCTCAACCAGAAGAAGTTGCTGATG的引物BMI1(5154-2)-P2用于PCR钓取目的基因并进行电泳。1.4重组质粒构建将PCR产物连接入线性化真核表达载体，PCR对序列为AATCTAAGGAGGAGGTGA的引物KL5154-P3和序列为gcaatagcatcacaaatttc的引物SV40pA-R进行鉴定，再用PCR鉴定重组克隆。1.5制备感受态细胞先配置以下溶液：0.1MCaCl2溶液，以0.22μm过滤除菌；250mMKCl2溶液；2MMgCl2溶液，高压灭菌；SOB:1ml250mMKCl2溶液加入100mlLB，以5MNaOH调PH值至7.0，高压灭菌，临用前加入0.5ml2MMgCl2溶液。然后用氯化钙制备新鲜的大肠杆菌感受态细胞，从于37oC培养16小时的新鲜平板中挑取一个单菌落，转到一个含有100mlLB培养基的1L烧瓶中；于37oC剧烈振摇培养3小时(旋转摇床，300转／分)；在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至0oC；于4oC,以4000转／分离心10分钟，回收细胞；倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽；以10ml用冰预冷的0.1mol／LCaCl2重悬每份沉淀，放置于冰浴上；于4oC，以4000转／分离心10分钟，回收细胞；倒出培养液，将管倒置1分钟,使最后残留的痕量培养液流尽；每50ml初始培养物用2ml用冰预冷的0.1mol/LCaCl2重悬每份细胞沉淀；将细胞分装成小份，放于-70oC冻存。1.6转化用冷却的无菌吸头从每种感受态细胞悬液中各取200μL转移到无菌的微量离心管中，每管加10μL连接液，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟；将管放到预加温到42℃的循环水浴中放好的EP管架上，恰恰放置90秒，丌要摇动EP管架；快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却l—2分钟；每管加800μLLB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育45分钟使细菌复苏；将150μL已转化的感受态细胞转移到AMP抗性（100ug/ml）的LB琼脂培养基上；将平板置于室温直至液体被吸收；倒置平皿，于37℃培养，16小时；长出的兊隆进行后续PCR鉴定。1.7阳性克隆的PCR鉴定以序列为GTGCCCTGTTGAAGGACC的引物KL0002-P3和序列为CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG的引物KL0002-P5进行PCR鉴定，并接种阳性转化子，37℃培养16小时后保存为甘油菌，分装200μL送测序。2结果2.1载体酶切结果GV144载体经BamHI和XhoI双酶切，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示，GV144载体已被切开成线性，如图1.图11#:10kbMarker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)2#:载体酶切产物3#:未酶切载体（从细菌中提取的质粒因可能存在超螺旋，开环，线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，故此时质粒的电泳条带只能作为质粒分子量大小判断的参考，不可作为准确判断依据。质粒经单酶切消化后，会呈现均一的电泳条带，此时可与Marker对比判断其分子量大小）2.2目的基因片段的获取PCR结果PCR产物大小为：1003。电泳图如图2.图2Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp2.3PCR鉴定重组克隆电泳图如图3：图31#：阴性对照（ddH2O）2#：阴性对照（空载自连对照组）3#：阳性对照（GAPDH）4#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp5#-12#：BMI11-8号转化子2.4阳性克隆测序结果及结果分析：比对结果：GCTGTACAAGTCCGGACTCAGATCTCGAGCTATGCATCGAACAACGAGAATCAAGATCACTGAGCTAAATCCCCACCTGATGTGTGTGCTTTGTGGAGGGTACTTCATTGATGCCACAACCATAATAGAATGTCTACATTCCTTCTGTAAAACGTGTATTGTTCGTTACCTGGAGACCAGCAAGTATTGTCCTATTTGTGATGTCCAAGTTCACAAGACCAGACCACTACTGAATATAAGGTCAGATAAAACTCTCCAAGATATTGTATACAAATTAGTTCCAGGGCTTTTCAAAAATGAAATGAAGAGAAGAAGGGATTTTTATGCAGCTCATCCTTCTGCTGATGCTGCCAATGGCTCTAATGAAGATAGAGGAGAGGTTGCAGATGAAGATAAGAGAATTATAACTGATGATGAGATAATAAGCTTATCCATTGAATTCTTTGACCAGAACAGATTGGATCGGAAAGTAAACAAAGACAAAGAGAAATCTAAGGAGGAGGTGAATGATAAAAGATACTTACGATGCCCAGCAGCAATGACTGTGATGCACTTAAGAAAGTTTCTCAGAAGTAAAATGGACATACCTAATACTTTCCAGATTGATGTCATGTATGAGGAGGAACCTTTAAAGGATTATTATACACTAATGGATATTGCCTACATTTATACCTGGAGAAGGAATGGTCCACTTCCATTGAAATACAGAGTTCGACCTACTTGTAAAAGAATGAAGATCAGTCACCAGAGAGATGGACTGACAAATGCTGGAGAACTGGAAAGTGACTCTGGGAGTGACAAGGCCAACAGCCCAGCAGGAGGTATTCCCTCCACCTCTTCTTGTTTGCCTAGCCCCAGTACTCCAGTGCAGTCTCCTCATCCACAGTTTCCTCACATTTCCAGTACTATGAATGGAACCAGCAACAGCCCCAGCGGTAACCACCAATCTTCTTTTGCCAATAGACCTCGAAAATCATCAGTAAATGGGTCATCAGCAACTTCTTCTGGTTGAGGATCCACCGGATCTAGATAACTGATCATAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTGCTTTAAAAAACCTCCCACACCTCCCCCTGA比对结果说明：测通ok3讨论多梳基因Bmi-1被证实在多种恶性肿瘤中高表达，且与临床分期、病理分型、淋巴结转移等相关，提示其在肿瘤发生、发展过程中起了重要作用。检测Bmi-1在肿瘤组织中的表达及其强度可以预测其预后，其与肿瘤预后的关系1963亦已被大量的研究结果所证实[4]-[6]。研究显示Bmi-l介导多种肿瘤干细胞自我更新和扩增，促进肿瘤的恶性进展[7]。目前认为肿瘤干细胞是药物抵抗和放化疗失败的重要原因，因此Bmi-1表达的调节作为一种潜在的治疗途径引起了广泛的关注，而Bmi-1基因过表达的研究可能会成为治疗恶性肿瘤的一个新方向。作为一种原癌基因，Bmi-1参与肿瘤的发生，还可与其它的原癌基因如ras或myc一起促进细胞的恶性转化[8]-[9]。过表达Bmi-1也可导致细胞的肿瘤性增殖。因此，Bmi-1可能成为肿瘤早期诊断的标志，并可能成为肿瘤基因治疗的靶点。参考文献：1AlkemaMJ，BronkM，VerhoevenE，eta1．IdentificationofBMI-1-interactingpmteinsasconstituentsofamuhimericmammalianpoly—combcomplex，GenesDev，1997；11：226—2402AlkemaMJ，WiegantJ，RaapAK，eta1．Characterizationandchromosomallocalizationofthehumanpinto—oncogeneBMI-1．HumMolGenet，1993：2：1597—16033hahanaK．ZouY．ItahanaY，eta1．Controlofthereplicativelifespanofhumanfibroblastsbyp16andthepolycombproteinBMI一1．MolCellBiol，2003：23：389—4014DimriGP．MartinezJL，JacobsJJ，eta1．TheBMI-1oncogenein—ducestelomeraseactivity