CD74基因敲除小鼠给予阿霉素的实验设计

1CD74的结构和功能ＣＤ７４，又名恒定链（ｉｎｖａｒｉａｎｔｃｈａｉｎ，Ｉｉ），是一种非多态性Ⅱ型跨膜糖蛋白，根据其分子大小有４种类型：ｐ３３、ｐ３５、ｐ４１、ｐ４３［３］。人类ＣＤ７４（ｐ３３）的结构可划分为３部分：胞质区（-ＮＨ２端，１～４６氨基酸残基），跨膜区（４７～７２氨基酸残基），内体腔区／胞外区（-ＣＯＯＨ端，７３～２３２氨基酸残基）（图１）［４］。Ｉｉ主要存在于细胞内，作为ＭＨＣⅡ类分子的分子伴侣，促进内质网加工释放ＭＨＣⅡ类分子，转运至胞内体，阻止ＭＨＣⅡ类分子在内质网内与内源性多肽结合。Ｉｉ参与免疫系统多种细胞的生理过程［５］。抗原递呈细胞缺乏Ｉｉ会影响抗原递呈和细胞能动性；在Ｂ细胞的成熟过程中，缺乏Ｉｉ的Ｂ细胞不能由过渡１型（ｔｒａｎｓｉ-ｔｉｏｎａｌｔｙｐｅ１，Ｔ１）Ｂ细胞分化为过渡２型（ｔｒａｎｓｉ-ｔｉｏｎａｌｔｙｐｅ２，Ｔ２）Ｂ细胞；胸腺Ｔ细胞缺乏Ｉｉ会导致异常的Ｔ细胞成熟。ＩＣ：胞质区（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）；ＴＭ：跨膜区（ｔｒａｎｓ-ｍｅｍｂｒａｎｅ）；ＥＣ／ＬＤ：胞外区／内体腔区（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｄｏｍａｉｎｓ／ｌｕｍｉｎａｌｄｏｍａｉｎｓ）Ｗｒａｉｇｈｔ等［６］于１９９０年报道约２％～５％的Ｉｉ表达于细胞表面（ｃｅｌｌ-ｓｕｒｆａｃｅＣＤ７４），如Ｂ细胞系，后陆续于上皮细胞、单核细胞等细胞表面发现ＣＤ７４的表达，且不依赖于ＭＨＣⅡ类分子的表达［７-９］。ＣＤ７４在细胞表面停留时间不到１０ｍｉｎ，但其快速内吞和更新使单个Ｂ类淋巴母细胞表面每日累计表达的４×１０６个ＣＤ７４分子［１０］。大部分细胞因子受体在外周血都存在可溶型形式，具有协同或拮抗配体生物功能的作用，可作为临床检测指标应用于疾病的诊治。可溶型细胞因子受体产生机制主要包括膜型受体胞膜外区蛋白水解酶酶切后的脱落，ｍＲＮＡ水平的差异剪接，囊泡样外体分泌以及糖基磷脂酰肌醇锚定分子的剪切等。Ｒｅｂｍａｎｎ等［１１］于１９９７年在外周血中检测到ＣＤ７４的可溶型形式，并证实可溶型ＣＤ７４是完整的、未经蛋白酶水解的ＣＤ７４蛋白，但后续未见相关报道；近日Ａｓｓｉｓ等［１２］新研发了一种检测可溶型ＣＤ７４的ＥＬＩＳＡ方法，发现可溶型ＣＤ７４为截短蛋白（ｔｒｕｎ-ｃａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ），分子量小于ＣＤ７４，推测其为膜表面ＣＤ７４的胞外片段，可中和ＭＩＦ因子的功能。2阿霉素阿霉素adriamycin，简称ADR，又称4-羟基柔红霉素，属蒽醌类抗生素，是一类在临床上广泛使用的具有广谱高效活性的蒽环类抗癌药物分子结构见图对于白血病乳腺癌肺癌及骨瘤恶性淋巴瘤等肿瘤都有显著疗效关于阿霉素的生理活性机制研究目前有两种观点一种认为ADM直接与DNA相互作用即经典的嵌入结合而导致对DNA复制及转录过程的抑制［２］另一种观点认为ADM和DNA嵌入结合后进一步诱导氧自由基的形成从而导致对核酸的切割［3］。其最显著的副作用是可以引发药物性心肌病而引起心力衰竭[4]，基于此特性，阿霉素被广泛应用于扩张型心肌病的实验模型[5]。3心肌损伤心肌病是指伴有心功能障碍的心肌疾病，根据其病因的不同可分为原发性心肌病和特异性心肌病[1]。在各种因素导致的心肌病中，氧化应激是心肌细胞损伤的核心环节[2]。目前通过采取有效措施保护心肌细胞，逆转心肌重塑，是治疗心力衰竭的重要方法。主要包括以利尿剂、地高辛和血管紧张素转化酶抑制剂为主的“三联疗法”。此外，大剂量维生素C、维生素E以及各种免疫治疗虽然取得一定疗效，但最终结果仍不理想[3]。近年来研究表明，心肌收缩蛋白的表现异常是MIF介导的信号通路及其功能研究综述时间：2014-07-12来源：学术堂巨噬细胞迁移抑制因子(macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)是第一个被发现的具有多效炎性介质功能的细胞因子，同时也是重要的内分泌激素，具有变位酶和氧化还原酶两大酶活性。MIF预先合成储存于胞质中，可由免疫细胞如单核/巨噬细胞、B细胞、T细胞，以及非免疫细胞如内皮细胞、上皮细胞、内分泌细胞、血管平滑肌细胞等合成;甚至在下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴中都有储存，以便在信号刺激时快速释放。MIF的产生释放受多种因素调节，包括细菌代谢产物、增殖信号、低氧、其他炎性因子(如IFN-γ、TNF-α、糖皮质激素等)。MIF无论是在胞内或者胞外都具有相应的功能，在正常情况下MIF的血清浓度为2～10ng/ml，且有昼夜波动现象。MIF具有独特的分子结构，与其他促炎因子有很大不同，仅在拓扑结构上与D-多巴胺变位酶同源。Lue等(2002)发现MIF的功能性分子为同源三聚体，其单体为12．5kD，具有2个α螺旋和6个β折叠。在MIF单体中，氨基酸片段50～68与86～102最为重要，二者都属于β折叠区，其中第57～60位氨基酸为氧化还原活性中心位点。当上述两个MIF片段突变或被特异性受体阻断时，相应的MIF酶活性降低，其诱导炎性因子释放的能力下降。一、MIF介导的信号通路MIF作为多功能的趋化因子，其可在胞内和胞外发挥相应的功能。因此，MIF既可作为信号分子作用于其他细胞，又可通过自分泌和旁分泌的形式进行自体调节和微环境调节。MIF通过与CXC家族、CD74等受体结合，通过与AKT、AMPK、EＲK等受体通路介导，发挥相应的作用。(一)MIF的相关受体与MIF相关的受体分子有CXC趋化因子受体家族的CXCＲ2、CXCＲ4和CXCＲ7，以及CD74和CD44。这些受体并不是孤立的，而是以受体复合物的形式(图1)结合MIF，传递信号。受体复合物包括CXCＲ2/CD74复合物和CXCＲ4/CD74复合物。CD74是在MHCII型抗原传递蛋白中起固定抗原肽作用的跨膜糖蛋白，无胞内活性部分，需与CD44构成复合物才能完成信号的转导;CD44无磷酸酶活性，MIF与CD74/CD44复合物结合后，使得其丝氨酸磷酸化，激活Src酪氨酸激酶通路，介导信号传递。不同的细胞系表达受体类型不同。单核细胞表面主要表达CXCＲ2;T细胞表面主要表达CXCＲ4;白细胞表面主要表达CXCＲ2和CXCＲ4。以上的这些受体均是G蛋白偶联受体。胞外的MIF只有在CXCＲ2存在的情况下，才能完成对白细胞的招募。MIF具有伪LＲ结构，因此可模拟ELＲ结构来代替相应CXCLs的功能，与CXCＲ2受体结合。研究证实，CXCＲ2可介导MIF的炎性趋化作用，以及动脉粥样硬化等疾病发生。CXCＲ4与AKT信号通路相关。MIF通过受体介导的信号传导不仅与质膜型受体(plasmamembranereceptor)有关，而且最新研究表明与内吞型受体(endocytosisoftheligatedrecep-tor)也有很大关系。在三种主要的内吞型受体中，与MIF相关的属于网格蛋白依赖型受体，与LDL胞吞机制有相似之处。MIF与细胞表面CX-CＲ4/CD74受体结合后，通过胞吞作用进入细胞，形成信号传导型胞内体，可参与信号传导。这一途径在单核细胞、T细胞等细胞系均有发现。这一胞内体途径与PI3/AKT信号通路有很大关系。当然，关于AKT通路的受体信号传导途径与具体细胞系有关。同时，ＲOS相关基因也与MIF内吞相关，Th1相关细胞因子如IFN-γ、TNF-α、IL-12等可促进MIF内吞;Th2相关细胞因子如IL-4、IL-10可阻止MIF内吞。上述这些受体信号通路为经典通路。更多的研究显示，在无CXCＲ2/4表达或CD74缺失的情况下，MIF的信号传递功能将相应降低或中断。但在横纹肌肉瘤细胞系(ＲMS)中，无CXCＲ2和CD74的表达，但MIF仍能通过CXCＲ4和CXCＲ7介导信号传递，调节细胞对其他趋化因子的反应性及细胞增殖与血管新生。同样，在无CD74表达的早幼粒细胞时期MIF也可以发挥功能。这些情况都有待于进一步的研究。(二)与MIF相关的信号分子通路与MIF相关的信号分子包括Jab1/JNK通路，PI3K通路、Akt、p53、EＲK1/2等(图1)，下面将针对这些分子做简要阐述。1．Jab1:Jab1是一可溶性胞浆蛋白，是CSN的亚单位，在N-末端含有MPN结构域，MIF与MPN结构域相结合。Jab1存在于胞浆内和核内。MIF与Jab1两者的影响是相互的。细胞自分泌或通过CD74受体胞吞摄入细胞体的MIF与胞内的Jab1直接结合，对Jab1有反向调节的作用，可抑制Jab1对JNK、AP-1等的磷酸化。Jab1可与核内p27结合，诱导p27出核，促进p27降解;MIF可阻止Jab1与p27的结合，导致p27的聚集，使细胞处于G1期。Jab1与MIF的结合导致MIF的移位与内在化，反馈抑制胞内MIF的合成。Jab1也可抑制MIF对Akt通路的活化作用。Jab1对多条信号通路都有调控作用，其可以调控β2整合素信号通路、MAPK信号通路以及JNK信号通路。2．JNK:JNK是MAPK家族成员，属于丝/苏氨酸蛋白激酶蛋白激酶，能结合c-Jun的氨基末端并激活c-Jun。c-Jun和c-Fos共同组成AP-1。AP-1是细胞核内重要的转录因子，通过MAPK信号传导通路活化。AP-1可调控细胞生长转化、上调炎性因子，调控癌细胞迁移等。MIF对JNK既有抑制作用又有促进作用，这一效果取决于细胞的类型。Jab1可使JNK磷酸化，进而激活AP-1。MIF与Jab1的结合可反向调节Jab1的作用，抑制其对JNK与AP-1的作用，且呈剂量依赖性。AP-1的下调会导致多种信号分子如Bcl-2、p53等的表达量下调。在缺氧情况下，心肌细胞通过这一通路下调JNK通路活性，进而下调bcl-2的表达，从而阻止心肌细胞凋亡，保护受损心肌。Bcl-2的下调可使得BAD等细胞凋亡蛋白下降，从而抑制细胞凋亡，这一效果在癌症的发生发展中也有重要作用。同时，存在MIF通过CD74受体活化JNK的通路:在T细胞中MIF与细胞表面的CXCＲ4/CD74受体结合，通过Src酪氨酸激酶活化，使得JNK上游分子PI3K激活，进而使得JNK/c-Jun/AP-1通路有一个快速、短暂的激活。这一反应使得下游的信号分子相应调整，如IL-8表达上调等。3．EＲK1/2:MIF通过CD74/CD44介导上调EＲK1/2通路的表达，这一通路主要由G蛋白偶联受体介导Ｒas-Ｒaf-MAPK/EＲKkinase-EＲK途径传导，也可经由酪氨酸激酶传导通路。Ｒas通路是连接MIF受体与Ets-1、Ap-1和c-Myc的信号通路。胞外的MIF也可通过内吞进入，与胞浆内的MLCK结合以发挥作用。MIF对EＲK1/2的激活有持续激活和快速短暂激活两种不同的机制。在持续激活通路中，Jab1的过表达会抑制MIF的活性，阻碍EＲK的磷酸化。同时，PI3K的抑制剂也可以抑制MIF对EＲK1/2的活化。相关研究表明，血清中MIF过高会阻碍这一通路的表达，而内分泌型MIF则会诱导该通路的持续活化。EＲK信号分子的上调可促进cox-2、PGs、p53、MSK等一系列分子水平的提高。在脊髓小神经细胞系中，MIF通过这一通路促进PGE2的表达上调，从而诱导cox-2的表达，这在炎症反应中有重要作用。同时，cox-2可抑制p53在细胞内的聚集，从而抑制细胞凋亡，这在自身免疫病与癌症发生中有重要作用。EＲK1/2通路还含有促进血管新生的作用，并通过对IL-8及MSK1和ＲSK1等下游因子的释放，来调节细胞活性。在短暂快速激活通路中，胞核内Elk-1转录因子的表达量明显上调。血清中MIF的量对EＲK的激活量效关系呈钟形，且受温度、pH等的影响。当给予短暂胞外MIF处理后，胞内EＲK通路会快速激活，这在持续激活通路中是不曾见到的。微量Jab1对EＲK1/2的上调是必须的。相关实验证实在短暂快速通路中MIF通过酪氨酸激酶传递信号，可使MEK1/2磷酸化，且应用其上游激酶Ｒaf-1的拮抗剂并不能完全阻断这一通路，说明存在MEK1/2上游的其他激酶参与了这一通路的发生。4．PI3K/Akt:MIF通过与CD74受体的结合使得Src酪氨酸激酶磷酸化，从