chapter3外植体选择和灭菌.

第三章外植体选择和灭菌一般来说，无论何种类型的细胞工程技术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种与培养等基本过程。§1、外植体的选择和灭菌一外植体的选择(一)外植体的基因型•不同种类的植物•同一植物的不同器官对诱导条件反应是不一致的，有的部位诱导分化的成功率高，有的部位却很难脱分化，或者再分化频率很低a.单子叶植物不易诱导器官发生。b.木本植物较难诱导。c.存在基因型差异（如番茄29%~63%）d.开始生长季节取材容易诱导。外植体种类及基因型(二)外植体的部位常用的外植体种类：①茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限）②茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易）③叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）；④花球和花蕾⑤种子、根、块根、块茎、花瓣、胚等。对于大多数植物来讲，茎尖是最好的部位，由于其形态已基本建成，生长速度快，遗传性稳定，也是获得无病毒苗的重要途径，但茎尖往往受到材料来源的限制，而采用茎段可解决培养材料不足的困难。•在选择植物外植体进行组织培养时，还要求考虑待培养材料的来源是否有保证，是否容易成苗；同时要考虑到该外植体，特别是经过脱分化产生的愈伤组织，是否会引起不良变异，丧失原品种的优良性状。选取适宜的外植体；常用外植体有茎尖、茎段、节间、叶片、叶柄等。C、流水冲洗外植体；D、外植体切割、分离及灭菌处理；E、外植体接种于诱导培养基。F、环境条件控制促进外植体的生长。(三)取材季节取材的季节以早春为好•不同植物的取材季节要求各有不同。对大多数植物而言，应在其生长开始的季节采样。•在生长末期或已进入休眠期时取样，则外植体可能对诱导反应迟钝或无反应，较难成活。•在母株生长旺盛的季节取材，不仅成活率高，而且增殖率也大。(四)器官的生理状态和发育年龄1幼年组织具有较高的形态发生能力作为外植体的器官，其生理状态和发育年龄直接影响形态发生。一般情况下，幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力，生理年龄越老的组织或器官，越接近发育上的成熟，其再生能力逐渐减弱甚至完全失去再生能力。外植体状态：2外植体的来源-生长在自然环境下的植物-有目的地培育在温室控制条件下生长的植物-无菌环境下已经过离体培养的植物自然环境中生长的植株，一般带有微生物，甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生菌。取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养效果。自然环境生长植株温室控制条件下生长植株已离体培养植株多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物材料作为外植体来源，减少培养过程中的微生物感染概率。同时，生长在控制条件下的植物可以保持培养料间的一致性，提高实验的可重复性，也便于培养技术的规范。某些多年生植物或特殊材料，必须取自自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对于培养过程中可能出现内生菌污染的材料，应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始培养的材料。3、供体植株的管理取自室外的外植体材料，供体植株的管理十分重要，这与外植体培养时的污染率密切相关。植株管理中应注意：⑴避免昆虫危害许多昆虫如蚜虫、螨类和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介，会引起植物组织的潜在感染。⑵注意防病尤其是真菌和细菌病害的侵染，取自感病植株的外植体，在培养中的污染率远远高于来自健康植株的外植体，必要时需使用化学药剂防治病害。⑶控制湿度给供体植株浇水时应从根部给水，避免从上部浇水，以免上部形成易于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室湿度；取材前尽可能保持植株干爽。3、材料取材⑴材料选择培养材料应选择有代表性的主要植物、选择性状优良的种质或特殊的基因型。快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，花药培养应在花粉发育到单核期取材。(五)外植体大小外植体大小：外植体越小成苗能力越弱，较大的外植体增殖较快。外植体极性：当外植体以形态学的基部接种于培养基上时，从远离基部的表面诱导出芽、苗数目较多。选取材料的大小一般在0.5-1.0cm之间。胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小难于成活。外植体取材方法--确定大小取大小适中的茎段、芽体进行清洗、灭菌，大了容易污染，小了不易成活。外植体的大小0.5-1cm，过大的外植体容易污染，过小存活率很低。外植体的大小外植体的来源生理学上的年龄取材的季节选材外植体的选择有什么要求?二、外植体的灭菌灭菌：是指用物理或化学方法将所有致病和非致病的微生物全部杀灭。•常用灭菌方法:干热灭菌:150度，40’1２0度，120’湿热灭菌:高压灭菌锅，压力达0.5kg/cm2时放气，压力达1.1kg/cm2,121度,16-30’射线灭菌:紫外灯过滤灭菌:细菌过滤器（孔径0.45um）熏蒸灭菌:每立方米体积2-8mL甲醛＋甲醛一半量的高锰酸钾火烧灭菌：酒精灯药剂灭菌：外植体(一)外植体的灭菌原则：杀菌又不伤害活细胞。（选择消毒剂，浓度、时间）药剂：能自动分解成低毒性或容易除去的药剂，如次氯酸钠能分解成杀菌的氯气，并易散失，是常用的，低浓度氯化汞效果好但难除；多次无菌水冲洗，用镊子翻动使药液均匀。1、预处理先对植物材料进行修剪整理，去掉不需要部分，将准备使用的植物材料（外植体）在流水中冲洗20-60分钟，备用。如特别不洁的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗10-15分钟，再用流水冲洗干净。2、表面灭菌（1）操作人员穿戴灭菌过的工作服、口罩。进入接种室前双手用洗涤剂清洗干净，操作前再用70%酒精或消毒剂擦洗双手。（2）操作期间双手和台面常用70%酒精或消毒剂擦拭。超净工作台使用前必须用紫外灯照射杀菌，然后开启风机。（3）接种用工具（解剖刀、剪刀、镊子）可放入70-75%酒精中，使用时需火焰灼烧灭菌，冷却后使用。（4）外植体放入超净工作台内置70-75%酒精中5-60秒材料消毒前常用70%酒精漂洗：70%具较强穿透力和杀菌力，湿润表面，驱尽茸毛间气泡，使药剂杀菌效果好。但时间太长会损伤材料。•幼穗、花蕾、花药：饱和漂白粉上清液10-20分钟•茎段、茎尖：0.1-0.2%升汞5-10分钟•成熟胚：次氯酸钠15-30分（活性氯2.5%）（＞=5.2%）•厚种皮种子：0.1-0.2%升汞30分-60分，幻胚次氯酸钠90-120分•表面活性剂，抽气、搅拌或超声振动，使消毒剂与材料充分接触。(二)污染原因和预防措施1、污染原因污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。病原菌：细菌及真菌两大类。⑴细菌污染特点-菌斑呈黏液状，接种后1-2天发现。污染途径：外植体带菌培养基及器皿灭菌不彻底操作人员未遵守操作规程⑵真菌污染的特点-污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后3-10天发现。污染途径：周围环境不清洁超净工作台过滤装置失效培养瓶的口径过大2、污染的预防措施⑴防止材料带菌的措施-茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养。无糖营养液或自来水使枝条抽枝，以新抽嫩枝作外植体。-晴天取材，下午取材，经日晒过可杀死部分细菌或真菌。-接种时除去外部韧皮组织，只接内部的分生组织。（2）外植体的灭菌-多次灭菌法，次氯酸钠-无菌水-次氯酸钠-多种药液交替浸泡法，肥皂水-酒精-次氯酸钠-无菌水。•（3）严格按照操作程序。第二节外植体无菌接种污染来源：空气中微生物，接种工具、材料、工作人员带菌一、接种室的消毒新洁尔灭擦地板、墙壁:使用前0.1%新洁尔灭擦地板、墙壁甲醛熏蒸：在接种前一天进行，按每立方米体积2-6mL甲醛，倒入烧杯中，取甲醛一半量的高锰酸钾倒入烧杯中，利用高锰酸钾的强氧化性而使甲醛挥发达到杀菌目的）（紫外线照射：接种前1小时进行，打开紫外灯照射20－30分钟，利用臭氧（O3）杀菌，停15－20分钟后开始接种）酒精喷雾二外植体的接种—无菌接种外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个过程均需无菌操作。烧烤瓶口，换滤纸，消毒剪刀，在酒精灯下方操作等。原则：杀菌又不伤害活细胞。（选择消毒剂，浓度、时间）药剂：能自动分解成低毒性或容易除去的药剂，如次氯酸钠能分解成杀菌的氯气，并易散失，是常用的，低浓度氯化汞效果好但难除；多次无菌水冲洗，用镊子翻动使药液均匀。•幼穗、花蕾、花药：饱和漂白粉上清液10-20分钟•茎段、茎尖：0.1-0.2%升汞5-10分钟•成熟胚：次氯酸钠15-30分（活性氯2.5%）（＞=5.2%）•厚种皮种子：0.1-0.2%升汞30分-60分，幻胚次氯酸钠90-120分升汞处理方法：升汞＋Na2S－－－絮状沉淀（至絮状沉淀不再产生为止）－－＋FeSO4（中和过多的Na2S）•材料消毒前常用70%酒精漂洗：70%具较强穿透力和杀菌力，湿润表面，驱尽茸毛间气泡，使药剂杀菌效果好。但时间太长会损伤材料。•表面活性剂，抽气、搅拌或超声振动，使消毒剂与材料充分接触。（三）工作人员：洗手，戴帽、口罩，70%酒精擦手。（四）无菌操作：烧烤瓶口，换滤纸，消毒剪刀，在酒精灯下方操作等。（1）借助接种用工具将材料切割分离。（2）将培养基放入超净工作台内，火焰灼烧培养基瓶口，然后打开培养瓶口，置培养瓶为斜角，避免灰尘落入平中。（3）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。（4）工具用后应及时灭菌，避免交叉污染。（5）工作人员操作时禁止不必要的谈话。第三节外植体的培养接种只是完成了离体培养的第一步，植物离体培养和栽培植物一样，生长过程中也受到各种环境因素的影响。培养条件是离体培养能否成功的关键。在培养基条件适宜的基础上，影响试管苗生长的主要因素有光照、温度、湿度、氧气。外植体的培养条件1、光照光照对植物生长发育有重要作用，是离体培养中非常重要的环境因素。光照强度、光质以及光照时间，对细胞的增殖、器官的分化都有很大影响。除特殊要求外，一般都采用日光灯作光源，光照强度1000-5000Lx，根据不同植物或器官需要，可以每天连续光照12-16小时。•马铃薯连续光照，葡萄要求短日照。•光质也影响芽的再生，蓝光有利于器官发生，烟草实验，而红光有利于根的发生。2、温度离体培养中对温度的控制比光照更为重要，大所数植物最适温度在23-32℃之间。培养室温度是25±2℃。低于15℃时，培养的组织生长停顿，高于35℃对生长也不利。因此，培养室应安装空调机或其他的控温设备。变温处理对有些植物器官发生有促进作用，如豌豆。3、湿度培养瓶内相对湿度通常是100%，而环境中的相对湿度会直接影响培养基的水分蒸发。因此，培养过程中，培养室一般要求相对湿度保持在70-80%，相对湿度过低影响培养物生长和分化，应向室内喷洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿。4、氧气离体培养的试管苗是需要氧气的，在固体培养或液体静置培养时，如果组织完全浸入培养基中，与氧气隔绝，就会停止生长。因此，接种时要有部分组织合空气接触。振荡培养是解决通气的良好办法。固体培养中，如瓶塞不透气，培养物也不能生长，要选择通气性好的培养瓶盖，增加可利用的氧气，迅速除去释放出来的CO2，有利于外植体外层细胞开始分裂。要注意保持培养容器内良好的通气性。维持适宜的氧气和二氧化碳浓度，防止有害气体的积累。第四节外植体的褐变及其防止措施一、褐变的原因及防止措施褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。一、褐变的原因及防止措施（一）褐变的原因褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激活，使细胞内的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种褐变物向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，抑制其它酶的活性，影响外植体的分化，最后变褐死亡的现象。⑴基因型某些植物酚类物质含量较多。⑵外植体的生理状态幼年的材料培养含醌类物质较少。⑶培养基的成分-过高的无机盐浓度-生长调节物质使用不当，BA过多-分生能力强的材料，氧化受抑制，褐变也被抑制-培养条件不适宜，温度过高或光照