CRISPRCas9

crispr/cas9CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs（crRNAs）来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。原理此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifyingfactor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的sgRNA，可靶定任何dsDNA序列，而sgRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。应用基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上开展基因功能研究、寻找合适药物作用靶标的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、对技术的要求很高，而且费用大，耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。即使对于技术比较成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠一般也需要一年以上。2013年1月份，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9技术在细胞系中进行基因敲除的新方法，该技术与以往的技术不同，是利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行切割导致突变。该技术迅速被运用到基因敲除小鼠和大鼠动物模型的构建之中。通过一系列研究，首先证明了通过RNA注射的方式将CRISPR-Cas系统导入小鼠受精卵比DNA注射能更有效的在胚胎中产生定点突变。在此基础上，又发现了该方法没有小鼠遗传品系的限制，能够对大片段的基因组DNA进行删除，也可以通过同时注射针对不同基因的RNA序列达到在同一只小鼠或大鼠中产生多个基因突变的效果。此外，还证明了利用CRISPR-Cas技术构建的基因敲除大鼠模型与传统方法构建的同一基因(肥胖相关G蛋白偶联受体Mc4R)突变大鼠相比具有一致的表型。该方法构建的基因突变动物具有显著高于传统方法的生殖系转移能力，是一种可靠、高效、快速的构建敲除动物模型的新方法。CRISPR-Cas技术是继锌指核酸酶(ZFN)、ES细胞打靶和TALEN等技术后可用于定点构建基因敲除大、小鼠动物的第四种方法，且有效率高、速度快、生殖系转移能力强及简单经济的特点，在动物模型构建的应用前景将非常广阔。技术优缺点CRISPR(ClusteredRegularlyInterspersedShortPalindromicRepeats)是细菌用来抵御病毒侵袭/躲避哺乳动物免疫反应的基因系统。科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶可在多种细胞(包括iPS)的特定的基因组位点上进行切割，修饰。RudolfJaenisch研究组将Cas9与Te1和Tet2特异的sgRNA共注射到小鼠的受精卵中，成功得到双基因敲除的纯合子小鼠，效率高达80%。他们将Cas9/sgRNA与带突变序列的引物共注射，能准确在小鼠两个基因引入所要的点突变。在ES细胞中他们更是成功的一次敲除了五个基因。与ZFN/TALEN相比，CRISPR/Cas更易于操作，效率更高，更容易得到纯合子突变体，而且可以在不同的位点同时引入多个突变。但该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究。传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。核酸酶ZFN/TALEN尤其是CRISPR/Cas技术如果能解决脱靶效应的话，有可能会广泛应用于小鼠，大鼠及其他模式动物的制备和研究中，成为传统的转基因和基因打靶技术的重要补充。CRISPR-Cas9：新一代基因编辑技术获得专利权2014年4月15日，隶属于麻省理工学院和哈佛大学的世界著名生物医学研究机构Broad研究所宣布，美国专利局批准了由他们所申请的基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术专利。这是目前世界第一例获得专利保护的基于CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术。正在生物体内发挥功能的CRISPR-Cas9系统。插画家：StephenDixon所谓基因编辑技术，是指对DNA核苷酸序列进行删除和插入等操作，换句话说，基因编辑技术使得人们可以依靠自己的意愿改写DNA这本由脱氧核苷酸写而成的生命之书。然而长期以来，对DNA的编辑只能通过物理和化学诱变、同源重组等方式来对DNA进行编辑。然而这些方法要么编辑位置随机，要么需要花费大量人力物力进行操作。因此，能够方便而精确的对DNA和核苷酸序列进行编辑，是科研工作者们长期以来的梦想。CRISPR-Cas9系统的诞生和成熟标志这这一梦想逐渐变为现实。此外不仅仅在科研界，在诸如医疗、农业、畜牧业等研究中，这一技术也显现除了巨大的应用前景。因此，这一技术获得专利，是该技术走向应用的里程碑式事件。从细菌免疫系统到DNA编辑工具CRISPR-Cas9系统并非天生就是为人类使用而产生的。它的本质其实是细菌中一种对付诸如病毒等外来DNA的防御系统。在一些细菌基因组中存在一系列成簇排列的DNA序列，被称作“规律间隔成簇短回文重复序列”（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats，CRISPR）。这些重复序列的间隔序列，被发现和很多能够侵入细菌的噬菌体DNA序列相同。进一步研究发现，这些序列在被转录成为RNA后，能够和细菌产生的一类称为Cas的蛋白质形成复合体，来对Cas蛋白起到导向作用，因此这段RNA也被称为导向RNA（guideRNA，gRNA）。当复合体检测到入侵的DNA和gRNA序列一致时，Cas蛋白就能够切割入侵的DNA，达到防御的目的。注：严格来说，在细菌体内gRNA由两部分组成：一部分为活化Cas蛋白所需的tracrRNA，另一部分为来自于间隔区、识别入侵DNA的crRNA。在人工构建的CRISPR-Cas9系统载体中，这两段RNA可融合为一条。CRISPR-Cas系统这种序列特异性的DNA切割机制很快引起了人们的兴趣。由于这一系统能够切割DNA，并且其序列特异性由crRNA的序列所决定，因此它成为了DNA编辑的理想工具。细菌中的CRISPR-Cas系统极为多样，而一个来自产脓链球菌（Streptococcuspyogenes）的由Cas9蛋白参与的系统被人们研究的最为透彻。因此人们对它进行了改造，将编码Cas9蛋白的序列及其附属元件共同制造成为一个单一的载体。同时为了能够让这些组分进入真核细胞的细胞核，还加入了入核信号元件。这样一来，只要科研人员只需针对需要编辑的DNA序列合成一段DNA序列，插入这个载体的特定部位。在转入宿主细胞后，产生的人工构建的gRNA就能指导Cas9蛋白切割宿主细胞特定的DNA序列，从而起到基因编辑的作用。CRISPR-Cas9基因编辑系统示意。图片来源：《生物化学与生物物理进展》DNA编辑的广泛前景CRISPR-Cas9系统，被称为第三代基因编辑技术。相比于它的两位前辈ZFN系统和TALEN系统，它有着一些无可比拟的优点。首先，CRISPR-Cas9系统的可用位置更多。理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可以用CRISPR-Cas9进行编辑的位置，可以说这一技术能对任一基因进行操作，而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点，这大大限制了使用范围。其次，CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性，例如可以通过对Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链，这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险。此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白，来在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响。第三，更为重要的是，CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步就能完成，几乎任何实验室都可以开展工作，而不需要向ZFN和TALEN那样借助商业公司的协助完成。由于以上特点，CRISPR-Cas9被评为2013年生物学10大突破之一。值得说明的是，CRISPR-Cas9系统在真核细胞中很多重要的研究，都是由华人学者张峰主持完成的。由于来源于细菌的CRISPR-Cas9系统在真核细胞内也能很好的工作，这显示出了其巨大的应用潜力。例如在基础科学研究领域，CRISPR-Cas9系统最多的是被用来定点敲除一些基因，从而便于研究这些基因的生物学功能。同时CRISPR-Cas9系统的商业化应用潜力也不容小视。例如在生物治疗领域，结合诱导多能干细胞（iPS）技术，人们可以将通过基因编辑修复的iPS细胞重新发育为正常组织和器官来供病人使用。而在家畜育种等工作中，对一些关键性状基因的编辑能够大大加快良种的育种速度。正是由于CRISPR-Cas9的诸多优秀特点和广泛的应用前景，因此它成为了专利申请的热门方面。尽管已经有多份应用CRISPR序列或Cas蛋白的技术专利，但这次Broad研究所获得批准的是第一份将一整套CRISPR-Cas9系统载体和操作方法包括在内的专利。这意味着今后使用这一技术进行基因编辑操作都将涉及这份专利所保护的内容。那么，专利的批准是否会妨碍这一技术的使用呢？目前来看，基础研究受到影响的可能性不大，因为Broad研究院的主任埃里克·兰德（EricLander）在专利宣布的新闻稿中表示：“考虑到Broad研究所的使命是为了加速我们对于疾病的理解和治疗，因此我们承诺授权给全球的研究团队使用这种技术的权利。”但是，在更有利可图的商业化应用领域，这一专利的出现是否会对使用该技术的企业造成影响还有待观察，毕竟Broad研究所在上述表态之外还有一句：“享有这一专利的限制权”。