CRISPRCas9监督复合体

DirectionalR-LoopFormationbytheCRISPR-CasSurveillanceComplexCascadeProvidesEfficientOff-TargetSiteRejection——CRISPR-Cas监督复合体（Cascade）提供有效的抑制脱靶位点的定向R-loop形成一、Background:以CRISPR/Cas9作为例子，解释这种复合体是如何靶向编辑基因的。CRISPR（Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats），被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统，也是一种对付攻击者的基因武器。后来，研究人员发现，它似乎是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞内的基因，这也意味着基因编辑器是一种可以广泛使用的生物技术。CRISPR担当细菌的防护罩CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，类似免疫记忆，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPRassociated)，缩写为Cas。目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。CRISPR的工作原理当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(PreRISPRRNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40%已测序的真细菌和90%已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用。此外，pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNaseIII核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。CRISPR／Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区(ProtospacerAdjacentMotif)的5'-GG-N18-NGG-3'特征区域中的NGG位点，而这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。修复有两种机制：HDR：同源重组修复，DSB出现之后，细胞会启动这种修复机制，以同源链为模板，对DSB进行修复。由于这种修复作用是以同源链为模板，而且还有位点特异性的核酸酶（site-specificnuclease）参与，所以其保真度非常高。利用HDR可以插入一个或者多个基因，也可以进行单碱基替换。NHEJ：非同源末端连接修复机制是另外一种DSB修复机制，通过这种修复可以将断裂的DSB末端直接连接起来。由于在这种修复过程中不会用到同源模板链，所以在断裂处容易出现小的插入或者缺失突变，常常会导致移码突变，使基因的功能遭到破坏。二、R-loop:如下图，已形成好了的Cascade复合体，先进行PAM序列识别，之后碱基互补配对会驱使R-loop形成，并且推进R-loop的延伸扩展，这时候另一端的反超螺旋就会增加。而在延伸的过程中，由于会遇到与自身的protospacer（也就是以前的记忆）不相符合的地方，会导致R-loop不能locking或者崩溃瓦解掉。如果进行顺利，到达protospacer的末端时，R-loop就会locking住，然后进行DNA的剪切。三、靶向识别双向通讯模型如下图，首先Cse1识别PAM序列，起始R-loop，之后推进R-loop的扩展延伸，这个时候R-loop的崩溃瓦解可能性是逐渐减小的。接着延伸的过程中，会遇到一些不能碱基互补配对的突变（off-target），这时候它要么瓦解，要么就容忍下来，继续推进接收器cse2到protospcer的末端，并且locking住，形成的构象变化可反馈给PAM，这样招募Cas3进行DNA剪切。它们认为这样的模型是双向通讯的，并且是有一定的容错性的。四、R-loop的定量检测就是用磁珠连接DNA，通过磁力可以影响磁珠并且扭动DNA，而形成plectonemicsuperhelix，这样就会使得DNA长度变化。而因R-loop的形成，又会引起DNA长度的改变，通过videomicroscopy就可以检测到，这样来观察R-loop的形成、解体等。太麻烦的不用管了，下图我觉得就能解释了，深蓝色是可容错且完全匹配Propospcer的超螺旋平均改变和浅蓝色是预想的从PAM延伸到脱靶突变位点的中间体R-loop的一个超螺旋平均改变。突变（off_target）考点：不知道，应该考靶向定位三个系统的比较等等。我觉得这个没啥好考的呀。