Dapper通过对WNT信号通路的调控缓解神经病理性疼痛的机制研究及其中所涉及的线粒体在其中扮演角色

Dapper通过对WNT信号通路的调控缓解神经病理性疼痛的机制研究及其中所涉及的线粒体在其中扮演角色的研究DapperstudybyWNTsignalingpathwayrelieveneuropathicpainmechanismsinvolvedinresearchandmitochondriaplayaroleinwhichDapperWNTsignalingpathwayneuropathicpainmitochondria越来越多的研究表明，正常线粒体的分裂融合运动对维持其功能有着重要的作用。线粒体形态的改变与其功能密切相关，过度分裂是导致细胞凋亡的重要原因，但关于线粒体分裂在脑缺血再灌注损伤中的作用目前仍不清楚。本研究首先在体内脑缺血再灌注损伤模型和体外脑缺氧复氧模型上，通过对细胞凋亡、线粒体形态和超微结构、线粒体Ca2+和活性氧、线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1、凋亡调节蛋白Bcl-2、Bax以及细胞色素C的表达等的检测，探讨线粒体分裂在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制，然后，再在上述实验模型上，通过对线粒体形态学及线粒体分裂相关蛋白表达的检测，探讨线粒体钙单向转运体MCU对线粒体分裂的调控作用；通过对线粒体钙、活性氧（ROS）及信号转导相关蛋白的检测，探讨MCU对线粒体分裂的可能调控机制。本研究将为脑缺血再灌注损伤提供新的理论基础和治疗靶点。1.1研究意义缺血脑组织在恢复血液灌注后，会发生细胞功能代谢障碍和结构破坏进一步加重的病理过程，称之为脑缺血-再灌注损伤。如何避免或减轻脑组织在循环中断后的缺血-再灌注损伤，是临床医学面临和需要解决的重要问题。细胞凋亡是导致缺血再灌注损伤的重要因素，因此，脑缺血再灌注损伤治疗的关键是减轻半暗带区的神经细胞凋亡。研究表明，线粒体在细胞凋亡中发挥着重要的作用[1,2]。近年来，有关细胞凋亡研究的关注点主要集中在线粒体的形态变化上，使线粒体分裂与细胞凋亡之间的关系成为研究焦点。线粒体分裂导致的线粒体片断化是细胞凋亡的前提，通过药物抑制线粒体分裂蛋白（dynamin-relatedprotein1，Drp1）可以抑制心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡[3]，减轻急性肾损伤后肾小管细胞凋亡以及缺血性视网膜病变后细胞凋亡[4,5]。但是关于线粒体分裂在脑缺血再灌注损伤中的作用目前仍不清楚。因此，本研究探讨线粒体分裂在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制，为脑缺血再灌注损伤提供新的理论基础和治疗靶点。1.2国内外研究现状及发展动态分析2.1线粒体分裂与细胞凋亡线粒体作为细胞凋亡的重要执行者[6]，其结构与功能异常可导致细胞凋亡。各种凋亡刺激引起的线粒体膜电位下降、膜通透性转换孔(permeabilitytransitionpore，PTP)开放以及细胞色素C(CytochromeC,CytC)、凋亡诱导因子(Apoptosisinducingfactor,AIF)等线粒体蛋白的释放被认为是诱导凋亡发生的重要事件[7]。Bcl-2家族是细胞线粒体途经凋亡的执行者。目前已经发现的Bcl-2蛋白家族按功能可分为两类，一类是与Bcl-2一样具有抑制凋亡作用的蛋白，如哺乳动物的Bcl-Xl、Bcl-W、Mcl-1等，而另一类具有促进凋亡作用的蛋白，如Bax、Bad、Bak、Bid等[8]。细胞凋亡时：首先Bax从胞浆转位到线粒体外膜，促使线粒体孔道开放，介导线粒体中CytC、凋亡蛋白酶活化因子1(Apoptoticproteaseactivatingfactor1，APAF1)释放到胞浆，从而激发caspase的级联激活反应，最终导致细胞凋亡。Bcl-2家族的Bcl-xL、Bcl-Xs、Bax、Bcl-2、Bad、Mc1-1等则可以形成蛋白二聚体，而特定的蛋白二聚体则可作为在细胞死亡信号通路上的分子开关。随着电子体层成像(electrontomography)和计算机技术在生物学中的发展及应用，人们对线粒体形态在凋亡中的改变越来越关注[9]。在生理状况下，线粒体是一种高度动态的细胞器，其在细胞内彼此连接，呈现立体的管网状结构，但其形态不是一成不变的，线粒体形态可以表现为椭圆形、长管状、网络状，以及短小状等不同形状，进一步观察发现线粒体发生频繁的融合与分裂，其分裂速度和融合速度处于一种平衡，这种平衡的破坏，往往伴随着线粒体形态的变化与机体的生理功能障碍[10,11]。在细胞凋亡发生时，线粒体分裂占优势，发生片段化，表现为线粒体短小，显微镜下成点状。在多种凋亡模型中都发现了线粒体的片段化，而且线粒体数量也显著增加，说明线粒体分裂对细胞凋亡的发生具有重要意义。尤其在神经细胞线粒体上也检测到线粒体分裂蛋白的存在，且其与神经元退行性疾病有密切的关系[12,13]。线粒体分裂受多种因素的调节。其中，线粒体分裂蛋白Drp1和Fis1在线粒体分裂过程中发挥重要作用。Drp1主要定位于细胞浆[14]，并以多聚体（可能是四聚体）的形式存在[15]。Drp1是一个大的GTP酶分子，其N端具有GTP酶结构域，C端为GTP酶效应结构域，中间是Dynam同源结构域。线粒体分裂时转位至线粒体外膜，并且富集于线粒体潜在的分裂位点[16]。多个Drp1分子围绕线粒体形成指环结构，并通过GTP水解改变分子间的距离或角度，逐渐压缩直至线粒体断裂，产生两个独立的线粒体。线粒体分裂后，Drp1重新回到胞浆[17]。Drp1分子加速线粒体的分裂，从而产生大量片段化的线粒体，通过过量表达Drp1k38a而抑制Drp1的作用，可以抑制线粒体的片段化，且抑制或延迟CytC的释放、线粒体膜电位的下降和核DNA的片段化等凋亡表现[18]。Fis1在线粒体分裂中也起一定作用，是一个17kD的保守蛋白，Fis1定位于线粒体外膜，通过C端的跨膜区锚定于线粒体外膜，其N端的TPR结构游离于胞浆，推测Fis1参与分裂复合物的形成，通过招募胞浆中的Drp1分子，共同聚集于线粒体潜在的分裂位点。Fis1缺失、突变的细胞中，这种聚集明显减少，线粒体分裂也受到抑制[19]。Fis1介导线粒体分裂是依赖Drp1实现的，超表达Drp1K38A则可以阻断Fis1的活性。在凋亡过程中，Drp1介导的线粒体分裂是凋亡的第一步（附图）。2.2钙离子与线粒体分裂钙离子作为广泛存在且至关重要的第二信使，参与了细胞的能量代谢、增殖以及凋亡等病理生理过程。Ca2+也可通过多种途径和机制影响线粒体融合-分裂的平衡。有资料证实，胞浆内Ca2+可通过介导Drpl磷酸化或去磷酸化作用来调节线粒体融合-分裂的平衡。Ca2+进入细胞后激活钙调神经磷酸酶(calcineurin，CN)或者蛋白磷酸酶2B(proteinphosphatase2B，PP2B)，从而引起Drpl丝氨酸637C或丝氨酸656C位点的去磷酸化，促进Drpl在线粒体表面的定位，加速线粒体分裂；给予PP2B阻断剂FKS06或环孢霉素A(cyclosporinA)处理可阻止这一现象的发生，而蛋白磷酸酶2A(proteinphosphatase2A，PP2A)抑制剂calyculinA作用后则无效，表明PP2B的作用可能是直接的。另据Han等[20]在神经细胞中研究发现，Ca2+通过电压依赖性钙离子通道(voltage-dependentcalciumchannels，VDCC)进入细胞后，激活Ca2+／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Iα(CaMKIα)，并由此引起Drpl丝氨酸600位点的磷酸化，其后Drpl与Fisl亲和力增强，分布于线粒体表面的数目增多，从而加剧线粒体分裂。在凋亡机制的研究中发现，线粒体Ca2+信号与线粒体分裂密切相关。BAP31作为caspase-8的底物，可诱导内质网钙离子的释放，使线粒体摄取钙离子增多，进而引起线粒体分裂加剧、CytC释放和细胞凋亡。通过抑制线粒体对Ca2+摄取均可抑制BAP31诱导的线粒体分裂。线粒体钙单向转运体(mitohondrialcalciumuniporter，MCU)位于线粒体内膜，其作用主要是将Ca2+从细胞浆转运至线粒体基质中而降低胞浆Ca2+浓度[21]。鉴于胞浆Ca2+和线粒体Ca2+的升高均是导致线粒体分裂的重要原因，线粒体钙单向转运体对线粒体分裂的影响尚不明确。我们课题组对线粒体分裂在脑缺血再灌注损伤中的作用进行了初步研究，发现抑制线粒体分裂蛋白Drp1可以抑制脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡[22]。同时在对线粒体钙单向转运体（MCU）的研究中发现，抑制MCU可以减轻脑缺血后神经细胞坏死和凋亡，减轻脑水肿和AQP4的表达[23,24],且此作用与其对线粒体MPTP的调控作用有关[25,26]。因此，本研究拟通过在体和离体实验，利用神经生物学、病理学、生物化学等相关技术，探讨线粒体分裂在脑缺血再灌注损伤中的作用及机制，并探讨线粒体钙单向转运体对线粒体分裂的影响及其调控机制。课题的结论有利于进一步明确线粒体在脑缺血再灌注损伤中的作用，完善脑缺血再灌注损伤的理论基础，为寻求脑保护作用的新靶点提供新的思路。