DNA凝胶电泳常用试剂配制

DNA的凝胶电泳1.琼脂糖凝胶电泳含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围常用电泳缓冲液缓冲液使用液浓储存液（每升）Tris-乙酸（TAE）1×:0.04mol/LTris－乙酸0.001mol/LEDTA50×:242gTris碱57.1ml冰乙酸100ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)Tris-磷酸（TPE）1×:0.09mol/LTris-磷酸0.002mol/LEDTA10×:108gTris碱15.5ml85％磷酸（1.679g/ml）40ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)Tris-硼酸（TBE）a0.5×:0.045mol/LTris-硼酸0.001mol/LEDTA5×:54gTris碱27.5g硼酸20ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)碱性缓冲液b1×:50mmol/LNaOH1mmol/LEDTA1×:5ml10mol/LNaOH2ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)a．TBE浓溶液长时间存放后会形成沉淀物，为避免这一问题，可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液，出现沉淀后则予以废弃。以往都以1×TBE作为使用液（即1：5稀释浓贮存液）进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1：10稀释的贮存液作为使用液。进行聚丙烯酰胺凝胶电泳使用的1×TBE，是琼脂糖凝胶电泳时使用液浓度的2倍。聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小，故通过缓冲液的电流通量通常较大，需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。b.碱性电泳缓冲液应现用现配。凝胶中的琼脂糖含量〔％（w/v）〕线状DNA分子的有效分离范围（kb）0.35－600.61－200.70.8－100.90.5－71.20.4－61.50.2－32.00.1－2凝胶加样缓冲液缓冲液类型6×缓冲液贮存温度Ⅰ0.25％溴酚蓝0.25％二甲苯青FF40%(w/v)蔗糖水溶液4℃Ⅱ0.25％溴酚蓝0.25％二甲苯青FF15％聚蔗糖（Ficoll）（400型；Pharmacia）水溶液室温Ⅲ0.25％溴酚蓝0.25％二甲苯青FF30％甘油水溶液4℃Ⅳ0.25％溴酚蓝40%(w/v)蔗糖水溶液4℃Ⅴ碱性加样缓冲液300mmol/LNaOH6mmol/LEDTA18%聚蔗糖（Ficoll）（400型；Pharmacia）水溶液0.15%溴甲酚绿0.25％二甲苯青FF4℃使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三：增大样品浓度，以确保DNA均匀进入样品孔内；使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利；含有在电场中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中泳动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBE作电泳液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5－1.4％的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。但是，对于碱性凝胶应当使用溴甲酚绿作为示踪染料，因为在碱性pH条件下其显色较溴酚蓝更为鲜明。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺〔％（w/v）〕a有效分离范围（bp）二甲苯青FFb溴酚蓝b3.51000－20004601005.080－500260658.060－4001604512.040－200702015.025－150601520.06－1004512a.N,N’-亚甲基双丙烯酰胺占丙烯酰胺浓度的1/3.b.给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片断的粗略大小（核苷酸对）30％丙烯酰胺：丙烯酰胺29gN,N’-亚甲基双丙烯酰胺1g加水至100ml将溶液加热至37℃使化学药品溶解小心：丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收。丙烯酰胺的作用具有累积性。称取粉末状丙烯酰胺及亚甲双丙烯酰胺时必须带手套和面具。取用含上述化学药品的溶液也要戴手套。尽管可以认为聚丙烯酰胺无毒，但鉴于其中可能含有少量未聚合的丙烯酰胺，故仍应小心处理。10％过硫酸铵过硫酸铵1g加水至10ml可在4℃保存数周。制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂的体积（总体积100ml）试剂制备不同浓度（％）凝胶所用试剂的毫升数3.5％5.0％8.0％12.0％20.0％30％丙烯酰胺11.616.626.640.066.6水67.762.752.739.312.75×TBE20.020.020.020.020.010%过硫酸铵0.70.70.70.70.7每100ml丙烯酰胺凝胶溶液加35ulTEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺），旋动容器混匀。公司：巩义市夹津口汇源供水材料厂地址：河南省巩义市高新技术开发区电话：[phone]传真：[phone]手机：[phone]手机：[phone]联系人：韩女士QQ：邮箱：[e-mail]网址：序列差异的有效手段，变性凝胶电泳在我室广泛使用，但是也有其使用范围。在我室还有一种常用的非变性凝胶电泳技术，简称SSCP（SingleStrandConformationPolymorphism，单链构象多态性）。原理：在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）被变性成为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。SSCP与变性凝胶电泳基本一致，不同之处有以下几点：a．SSCP使用非变性凝胶进行电泳，即在凝胶配制中不加入变性剂。我室常用8%非变性胶（丙烯酰胺80g，N-N，-亚甲双丙烯酰胺2.76g，10×TBE50ml，加水定容到1L）b．工作环境，由于SSCP受温度影响，所以在电泳过程中应防止温度的升高，所以电泳环境为电压400V，电流50mA，单板电泳功率为9W，不用预热。缓冲液最好用新配制的。c．由于电泳功率较低，所以电泳时间较长，通常需要10小时以上，因此一般电泳需要过夜。室温在25。C以下。1.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳适宜分离鉴定低分子量的蛋白质，小于1kb的DNA片段和DNA序列。分析装载的样品容量大，可回收，DNA纯度高。在催化剂TEMED（N-N-N，-N，-四甲基乙二胺）和过硫酸胺的作用下，丙烯酰胺聚合成长链，聚丙烯酰胺链在交联剂，N-N，-亚甲双丙烯酰胺的参与下，聚丙烯酰胺链与链之间交叉联结形成凝胶。1.1配制30%丙烯酰胺：丙烯酰胺29gN-N，-亚甲双丙烯酰胺1g加水至100ML，40C棕色瓶可保存二月1.2配制5×TBE缓冲液：TRIS碱54克硼酸27.5克EDTA3.72克加水至1L1.3制备聚丙烯酰胺凝胶所用试剂体积试剂制备不同浓度（%）凝胶所用试剂体积（ml）3.55.08.012.020.030%丙烯酰胺11.616.626.640.066.6水67.762.752.739.312.75×TBE20.020.020.020.020.010%过硫酸铵0.70.70.70.70.71.4DNA在聚丙烯酰胺凝胶中有效分离范围丙烯酰胺（%）有效分离范围（bp）二甲苯氰FF溴酚蓝3.51000-20004601005.080-500260658.060-4001604512.040-200702015.025-150601520.06-10045122.聚丙烯酰胺凝胶电泳具体步骤2.1从NaOH池中捞出浸泡的玻璃板，取出上面的残胶2.2把玻璃板拿到流动水处洗刷干净2.3洗干净的玻璃板至于玻璃板架上晾干2.4用乙醇擦洗玻璃板2.5带凹口的背板涂上硅化剂，面板则涂上粘合剂，防止电泳完毕发生撕胶和脱胶的可能（涂摸要均匀）2.6面板在下，背板在上。两侧用塑料板密封，并用夹子夹好。底部调节使之水平2.7将加入催化剂后的凝胶沿凹口均匀倒下，插入适当的封条。勿使封条下留下气泡。用夹子夹紧封条部位2.8室温聚合30分钟，小心取出凹口处封条，用水冲洗加样孔（否则封条所残留的丙烯酰胺在加样孔聚合产生不规则表面，引起DNA带变形）2.9将凝胶固定在电泳槽里。带凹口背板朝里，面向缓冲液槽2.10用0.5×TBE灌满电泳槽的缓冲液槽，接上电极，打开电源。调试工作环境为电压2000-2200V，电流150-200mA，单板电泳功率为80W。预热30分钟左右。2.11点样之前需切断电源，用枪将点样孔的气泡及胶吹出，然后插入点样梳，注意不要插得太深，否则点样胶面会变形，影响美观及点样。2.12枪吸加样品，PCR产物先加loadingbuffer10ul,再变性5分钟左右，接着在冰水中冷却5分钟以上方可点样，点样完毕，电泳开始。2.13电泳至所需位置后，切断电源，拔出导线，回收缓冲液，卸下玻璃板。在工作台上，将背板撬起，放回原处。将面板进行银染3.电泳后的银染检测3.1原理：影像产生是由于核酸在胶上所占部位与周围的氧化——还原势不同而产生。银染液中的银离子（Ag+）可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，这样核酸电泳带就染成了黑褐色。3.2银染银染液的配制：称2.5至3.0gAgNO3加1200---1400ml水银染:将电泳完的面板首先在银染漂洗盆了漂洗赶紧，使胶面上没有异物。玻璃板反面没有污染物。将加入银染液的银染盆放在摇床上后，将面板放入银染1小时左右。3.3显影显影液的配制：NaOH---20g,Na2CO3----0.6g,甲醛4.5ml，加水1200ml显影：将面板从银染盆里取出，在银染漂洗盆里漂洗，震荡5-6次，取出后使其表面尽量无水，再放入已加入显影液的显影盆里（显影，显影液的配制及甲醛的加入都需要在通风橱的摇床上进行）显影过程大约10到15分钟，以DNA条带清晰可见为准。将显现完毕的板子在显影漂洗盆里漂洗后，方可读带。一、电泳试剂：1、30％聚丙烯酰胺(29:1)丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。2、10％过硫酸胺过硫酸胺1克，水10ml。3、TEMED4、5xTBETris27克，硼酸13.75克，0.5MEDTA(pH8.0)10ml，定容至500ml。二、银染试剂1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。2、0.2%AgNO3：AgNO31克，水500ml。3、1.5%NaOH：NaOH7.5克，水500ml。4、37％甲醛。三、配胶(6%)：30％聚丙烯酰胺(29:1)8ml，5xTBE8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺200ul；TEMED20ul。室温凝固时间1小时。四、银染：1、固定液固定10m。2、水洗2mx3次。3、0.2%AgNO3100ml＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。4、水洗20秒x2次。5、1.5%NaOH100ml，加37％甲醛0.5ml，混匀，显色3～10m。6、水洗若干次，终止显色。电泳时间：150vx3h，溴酚兰的位置相当于40bp。银染后胶面积将膨胀10％。在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深我国的试剂规格基本上按纯度（杂质含量的多少）划分，共有高纯、光谱纯、基准、分光纯、优级纯、分析和化学纯等7种。国家和主管部门颁布质量指标的主要优级纯、分级纯和化学纯3种。（1）优级纯（GR：Guaranteedreagent），又称一级品或保证试剂，99.8%，这种试剂纯度最高，杂质含量最低，适合于重要精密的分析工作和科学研究工作，使用绿色瓶签。（2）分析纯（AR），又称二级试剂，纯度很高，99.7%，略次于优级纯，适合于重要分析及一般研究工作，使用红色瓶签。（3）化学纯（CP），又称三级试剂，≥99.5%，纯度与分析纯相差较