DNA序列测定.

DNA序列测定讲课内容：•一、Sanger双脱氧核苷酸链末端终止法原理•二、化学裂解法原理•三、长链DNA序列测定的基本策略•四、DNA的序列分析的自动化•五、310型DNA测序仪测定DNA序列的基本步骤•DNA序列测定，是指DNA一级结构的测定，即DNA分子中核苷酸的排列顺序的测定。是现代分子生物学中一项重要技术。•DNA测序技术是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立和发展起来的。•该凝胶含6%~8%丙烯酰胺，具有分离DNA片段的分子筛效应,能分离仅有一个碱基差别,而长度达300~500个碱基的寡核苷酸片段。•含有高浓度尿素，具有破坏氢键及防止氢键形成的作用，以确保变性测序的DNA单链彼此不相联接，也不因分子内形成氢键而折叠待测DNA片段TGGAACCTC生成系列相差TGGAACCT一个碱基的DNATGGAACC片段TGGAACTGGAATGGATGGTGT-TGGAACCTTGGAACCTGGAACTGGAATGGATGGTG+T•目前应用的两种快速序列测定技术:•Sanger等（1977年）提出的酶法-双脱氧链终止法•Maxam和Gilbert（1977年）提出的化学降解法•其中双脱氧链终止法是目前DNA序列分析应用最多最好的方法Sanger双脱氧核苷酸链末端终止法1958年和1980年诺贝尔化学奖获得者英国生物化学家弗雷德时里克·桑格基本原理：•通常DNA的复制需要：DNA聚合酶，单链DNA模板，带有3‘-OH末端的单链寡核苷酸引物，4种dNTP（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）。聚合酶用模板作指导，不断地将dNTP加到引物的3’-OH末端（新掺入的脱氧核苷酸5’-P-OH与前一核苷酸的3’-OH以磷酸二脂键相连），使引物延伸，合成出新的互补DNA链。PEAppliedBiosystemsTCGACGTGACTCGACGACTGGCCTAATCGAGTCAGTTHEPROCESSPEAppliedBiosystems•如果加入一种特殊核苷酸，双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），它与普通dNTP不同，它的戊糖的2’、3’-碳原子上均无-OH，由于它具有5’-P-OH能与前一核苷酸的3’-OH以磷酸二脂键相连，但因不具有3’-OH，故不能同后续的dNTP相连，于是DNA链的合成就此终止。脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较•这样以待测序列的DNA为模板，加入引物和4种dNTP（其中一种为α-32P标记），将此反应物分为4等份，每份内加入一定比例的一种ddNTP，如此形成A、T、C、G四个反应体系，最后在各反应体系中加入DNA聚合酶催化DNA片段合成。这样各反应体系中即可形成一种全部具有相同的5’-引物端和一种以ddNTP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段。DNA模板ATTGCAGTCGAC生成的新链TAACGTCAGCTGT管：C管：TAACGTCAGCTTAACGTCAGCTAACGTTAACGTCTTAACG管：A管：TAACGTCAGCTGTAACGTCATAACGTCAGTAATAACGTA•将制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳板上进行电泳，每组一泳道，四条泳道相邻并列，每条泳道上按产物分子量小→大从正极到负极（胶板的下→上）分离开来，依次排列。•由于各产物均带有放射性标记，以上结果经放射自显影，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。PEAppliedBiosystemsTAACGTCAGCTG•TAACGTCAGCT•TAACGTCAGC•TAACGTCAG•TAACGTCA•TAACGTC•TAACGT•TAACG•TAAC•TAA•TA•TPEAppliedBiosystemsCAGTTemplatePrimerdATPdNTPPolymeraseTerminatorPEAppliedBiosystemsRADIOACTIVEMETHODPEAppliedBiosystemsTHEPROCESSTCGACGTCGACGTCGACGTTAAACTGGCCTAATCGAGTCAGTTGACCGGATPEAppliedBiosystemsPEAppliedBiosystemsPEAppliedBiosystemsPEAppliedBiosystemsPEAppliedBiosystems双脱氧末端终止法的主要操作步骤PEAppliedBiosystems1．获得待测DNA片段的单链模板：•一般采用基因工程的方法以获取一定数量的单链待测DNA模板。可将待测DNA片段与噬菌体M13DNA进行重组，然后将其导入大肠杆菌进行增殖，M13噬菌体一般以单链DNA形式透出细胞再感染新的细菌，故此可获得单链DNA模板。•通过PCR扩增获得待测模板PEAppliedBiosystemsPEAppliedBiosystems2．合成寡核苷酸引物：•在待测DNA片段的3’-端合成一段互补的寡核苷酸引物，其顺序可为待测DNA片段3’-端的一段已知顺序，也可为一段M13噬菌体的顺序。可利用DNA合成仪自动合成。（待后讨论）PEAppliedBiosystems3．测序反应•将待测单链DNA模板、寡核苷酸引物、DNA聚合酶，四种dNTP、一种带放射性同位素标记的脱氧核糖核酸（如α-32P-dATP）混合。PEAppliedBiosystems•将上述杂交混合液均分为四份，每份混合液分别加入一种双脱氧核糖核酸（ddATP，ddGTP，ddCTP或ddTTP）。并在适当温度条件下进行保温处理，使引物与DNA单链模板的3'-端进行杂交。PEAppliedBiosystems•然后在适当温度条件下延伸互补链，就可得到四组分别以A、G、C、T、终止的长短不一的互补链的混合物。因为在互补链合成时，如掺入的是双脱氧核糖核酸，由于缺乏3`-OH，故可导致互补链合成终止。PEAppliedBiosystemsPEAppliedBiosystems4．电泳分离：•将四组含有长短不等的反应混合物在同一聚丙烯酰胺凝胶板上进行电泳，即可将只相差一个核苷酸的寡核苷酸链分离开。PEAppliedBiosystemsPEAppliedBiosystems6．放射自显影：•将电泳凝胶与X光胶片压在一起，于低温下自显影数天，即可得到放射自显图谱，通过该图谱即可直接读出核苷酸的排列顺序。PEAppliedBiosystems化学裂解法（Maxam－GilbertDNA序列分析法）沃尔特·吉尔伯特Maxam-Gibert化学修饰法测定DNA序列的原理用化学试剂处理具有末端放射性标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组具有各种不同长度的DNA链的反应混合物，经凝胶电泳分离和放射自显影，便可直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。Maxam-Gibert化学修饰法测定DNA序列的原理化学试剂肼：能够裂解嘧啶环，进而导致其脱落但是在高浓度的Nacl条件下，只对胞嘧啶起作用。硫酸二甲脂：使嘌呤甲基化，在中性环境下主要作用于G甲酸：使嘌呤环上的氮质子化导致糖苷键被削弱，进而嘌呤环被吡啶所取代。Maxam-Gibert化学修饰法测定DNA序列的原理5，-GATCACTACTG-3，5，-GATCACTACTG-3，GG+AC+TCGG+AT+CC•由于种种原因（如采用32P进行放射性标记、末端标记DNA的比活度、裂解位点的统计学分布、凝胶技术方面的局限性等等），Maxam-Gilber法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。•化学降解较之链终止法具有一个明显的优点：所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成所产生的拷贝。因此，利用Maxam-Gilbert法可对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况。•但随着M13噬菌体和噬菌粒载体的发展，也由于现成的合成引物唾手可得及测序反应日臻完善，双脱氧链终止法如今远比Maxam-Gilbert法应用得广泛。由于Sanger法既简便又快速，因此是现今的最佳选择方案。事实上，目前大多数测序策略都是为Sanger法而设计的。长链DNA序列测定的基本策略•开始测序之前，必须根据待测序列区的长度、所要求的测序精确度以及现有的设施来制定测序总策略。只有一小部分的研究计划需要从头测定大段从未测定过的序列，而更多的情况是要通过测序对突变进行定位和鉴定，并证实所构建的重组DNA的方向与结构。根据目的的不同，大致有两种方略。（一）确证性测序确证性测序(例如对利用寡核苷酸介导的诱变而产生的突变体进行测序)往往只需要进行仅仅一套反应，取得双链DNA其中一条链上局部区域的核苷酸序列，通常只须对亚克隆于M13噬菌体或噬菌体载体上的一段合适的限制酶切片段进行测序，即可如愿以偿。只要可能，应同时测定野生型基因上同源区的序列和突变体的相应序列，直接在同一张放射自显影片上对照有关序列，即有助于确证变异区序列并将使突变体与野生型基因之间任何出乎意料之外的其他差异一目了然。（二）从头测序从头测序的目的是要提供一段DNA的准确核苷酸序列，这一区段可长达数千碱基，而其序列从来未经测定。由于单套测序反应所能准确测定的靶DNA序列最长可达400碱基左右，因此进行从头测序必须经过精心策划。•对长约400碱基的靶DNA可以按互为相反的方向分别克隆于2种M13嗜菌体载体上。然后每条链的全序列可以利用通用测序引物进行的单套反应得以测定。•对长的DNA链进行测序只能将其分割成适合解读长度的片段后分段测序，然后再合成完整的长链DNA序列。从头测序常用的方法有三种：随机法嵌套缺失法引物延伸法随机法（又称鸟枪法）将长链DNA随机断裂成适于测序的片段，方法可有超声波处理、核酸酶Ⅰ切割、限制性酶切割等，将随机切割出的子片段分别插入到载体的多克隆部位，进行克隆扩增，对不同的片段分别测序，然后将他们重叠排列，便可连出整体DNA的全长序列。或将个片段序列输入计算机处理，可整合出整个DNA序列。全基因组鸟枪法测序的主要步骤•第一，建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。克隆数要达到一定数量，即经末端测序的克隆片段的碱基总数应达到基因组5倍以上。•第二，高效、大规模的末端测序。•第三，序列集合。•第四，填补缺口。全基因组鸟枪法测序的拼接困难：1、数据量极大:对众多子片段克隆、测序，通常要测定比实际DNA所含核苷酸数多几倍的序列2、大量重复序列造成拼接途径的不确定3、难免遇到某些片段的序列出现多次而有的片段部分不出现的现象嵌套缺失法（又称互套缺失法）该法基本原理是基因DNA链的一端与载体相连固定，另一端在核酸外切酶的作用下随着时间的延长，较匀速地消化变短，这样可人为获得一组长度不等的从一端开始缺失的DNA片段。然后从缺失端开始测序，这样每段的基因起始部分的序列总是与前一基因片段序列的后面部分重合，这样彼此套接可以很准确地测出整个基因的DNA序列。嵌套缺失法的基本操作步骤构建待测DNA重组体并进行增殖用限制性酶切割生成线状DNA用核酸外切酶Ⅲ、核酸酶Ⅰ特异消化DNA构建各特异缺失ＤＮＡ片段的重组体并进行增殖嵌套缺失体系的ＤＮＡ测序引物延伸法该法基本原理是从基因的3’端，依赖特定引物可合成一定长度的互补DNA链，用于测序。再根据该序列，设计新的寡核苷酸作为下一延伸段的引物，如此逐步向前推进，最终测得目的基因（长链DNA）的全长序列。优点该法的是无须克隆目的DNA的各部分，整个测序循序渐进。缺点是需要合成许多引物，费时费力，而且不能测定含有重复序列的DNA片段，因为与重复序列的互补引物会立即经退火结合到多个位点上。DNA的序列分析的自动化Sanger法测序技术的发展•手工测序•仪器自动测序聚丙烯酰胺凝胶电泳377毛细管电泳31031003700•DNA测序的自动化是在Sanger的双脱氧链末端终止法的基础上有美国应用生物系统公司进一步发展起来的激光测序法，其基本原理与末端终止法一样，都是通过ddNTP竞争性的终止新合成的DNA链。•激光测序法是合成