DNA拓扑异构酶概述

DNA拓扑异构酶综述摘要：DNA拓扑异构酶为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称，是一种见于真核细胞和原核细胞中的重要生物酶，其对DNA转录、复制、染色体分离及基因表达等过程中的DNA拓扑结构起着重要的调控作用。研究发现，与正常细胞不同，DNA拓扑异构酶在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达，而许多抗肿瘤药物的作用机制也与DNA拓扑异构酶密切相关，因此它作为抗肿瘤药物的重要靶点引起了研究者的广泛关注。此外，科学家们还发现拓扑异构酶在神经发育调节上也起着一定的作用，虽然机制还需要进一步研究，但这一发现就有着重要意义。本文对DNA拓扑异构酶的反应、结构、分类及生物功能进行了简要的归纳，介绍了DNA拓扑异构酶抑制剂的研究及分类，并对拓扑异构酶在其他方面上的进展进行了简单的介绍。关键词：DNA拓扑异构酶拓扑异构酶抑制剂抗肿瘤药物生物功能DNA拓扑异构酶（topoisomerase）调控DNA超螺旋状态，它是存在于细胞核内的一类酶，参与DNA复制、重组、转录、修复等核内关键作用，它们能够催化DNA链的断裂和结合，从而影响DNA的拓扑状态。真核细胞的拓扑结构由两种关键拓扑异构酶拓扑异构酶I和拓扑异构酶II调节，拓扑异构酶I通过形成短暂的单链裂解-结合循环，催化DNA复制的拓扑异构状态的变化；相反，拓扑异构酶II通过引起瞬间双链酶桥的断裂，然后打通和再封闭，以改变DNA的拓扑状态。哺乳动物中，拓扑异构酶II又可以分为αII型和βII型。拓扑异构酶的应用也很广泛，如现已知这些酶是很多抗肿瘤药物的细胞内靶酶，在肿瘤细胞中，拓扑异构酶的含量高于正常细胞，所以以其为靶点的抑制具有一定特异性，因此对它的研究也越来越重视。1、DNA拓扑异构酶I拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如ATP或NAD。E.coliDNA拓扑异构酶I又称ω蛋白，大白鼠肝DNA拓扑异构酶I又称切刻-封闭酶(nicking-closingenzyme)。DNA拓扑异构酶能催化的反应很多，如DNA拓扑异构酶I对单链DNA的亲和力要比双链高得多，这正是它识别负超螺旋DNA的分子基础，因为负超螺旋DNA常常会有一定程度的单链区。负超螺旋越高，DNA拓扑异构酶I作用越快。现已知道，生物体内负超螺旋稳定在5%左右，低了不行，高了也不行。生物体通过拓扑异构酶I和II的相反作用而使负超螺旋达到一个稳定状态。现已发现，编码E．coli拓扑异构酶I的基因topA发生突变，则会引起旋转酶基因的代偿性突变；否则，负超螺旋增高，细胞生活能力降低。拓扑异构酶I作用的碱基序列特异性不高，但切点一定在C的下游方向4个碱基(包括C本身)的位置。在将DNA单链切断后，拓扑异构酶I连接于切口的5端，并贮藏了水解磷酸二脂键的能量用以连接切口，因而拓扑异构酶I的作用不需能量供应。此外．拓扑异构酶I还能促进两个单链环的复性，其作用是解除复性过程所产生的链环数的负值压力，以使复性过程进行到底。如果在一个单链环上一个部位切断，而使另一部位绕过切口．则可产生三叶形结构分子(trefoilknot)。如果有两个双链环，其中一个有一个切刻，拓扑异构酶I则可以将切刻对面的一条链切断，使完整的双链环套进去，再连接起来而成为环连体分子(catenane)。拓扑异构酶Ⅰ最早是1971年在大肠杆菌中被发现的，均为单体酶。拓扑异构酶Ⅰ根据其结构域功能可以划分为4个域:C端结构域(Cterminaldomain)、核心结构域(coredomain)、连接子区域(linkerdomain)和N端域(N-terminaldomain)，其中C端结构域、核心结构域在催化活性中起主要作用。在拓扑异构酶Ⅰ的多个活性位点中，Arg488、Arg590、His632和Tyr723为研究比较明确的4个活性位点［7，8］。除Tyr723位于羧基端结构域外，其余三个均位于拓扑异构酶Ⅰ的核心结构域，如下图所示。（左a：TOPOⅠ晶体结构；右b：TOPOⅠ活性位点）2、DNA拓扑异构酶II拓扑异构酶II能同时断裂并连接双股DNA链．它们通常需要能量辅因子ATP。在拓扑异构酶II中又可以分为两个亚类：一个亚类是DNA旋转酶(DNAgyrase)，其主要功能为引入负超螺旋，在DNA复制中起十分重要的作用。迄今为止，只有在原核生物中才发现DNA旋转酶，另一个亚类是转变超螺旋DNA(包括正超螺旋和负超螺旋)成为没有超螺旋的松弛形式(relaxedform)。这一反应虽然是热力学上有利的方向，但不知道为什么它们仍然像DNA旋转酶一样需要ATP，这可能与恢复酶的构象有关。这一类酶在原核生物和真核生物中都有发现。大肠杆菌的拓扑异构酶II除了引入负超螺旋以外．还具有形成或拆开双链DNA环连体和成结分子的能力。II类拓扑异构酶没有碱基序列特异性，它们可以和任何相交的两对双链DNA结合。DNA旋转酶有两个α亚基和两个β亚基。α亚基约105KD，为gyrA基因所编码，具有磷酸二脂酶活性，可为萘啶酮酸(nalidixicacid)所抑制。β亚基约95KD，为graB基因所编码，具有ATP酶活性，可为新生霉素(novobiocin)所抑制。这两种药物均可抑制野生型大肠杆菌的DNA复制。可见DNA旋转酶为E．coli的复制所不可缺少的。在切断一条DNA双链后，两个a亚基各结合于切口的一个5'端，并贮藏了水解磷酸二酯键而获得的能量，由于该酶的整体性，因而DNA链的四个断头并无任意旋转的可能性。由于酶的别构效应，使完整的双链穿过切口，然后再重新形成磷酸二酯键。β亚基的功能在于水解ATP以使酶分子恢复原来的构象，以便进行下一轮反应。这一点可以用ATP的同系物β,γ-亚氨基ATP代替ATP而得到证实。因为这一同系物不能被DNA旋转酶所水解，但它确能促进第一轮拓扑异构反应，使负超螺旋增加，而妨碍以后进一步的拓扑异构反应。真核生物拓扑异构酶Ⅱ为同源二聚体，包括的两个亚型拓扑异构酶Ⅱα和拓扑异构酶Ⅱβ分别定位于染色体17q21—22［10］和3p24［11］单拷贝基因编码的二聚体蛋白。拓扑异构酶Ⅱ可划分为三个不同区域:C端域、N端域(ATP结合域)以及中部功能域（如下图右）。DNA拓扑异构酶的C端域在其对DNA的构象识别方面起主要作用，N端域和中部功能域则为拓扑异构酶的主要活性域，如下图所示。（左上a：TOPOⅡ结构；右上b：TOPOⅡ活性域）3、应用（DNA拓扑异构酶抑制剂---抗肿瘤药物的研究）3.1作用原理对于DNA拓扑异构酶抑制剂的作用原理，我们可以通过影响拓扑异构酶作用过程的各个阶段来破坏酶的活性。既可以直接作用于DNA，也可以作用于拓扑异构酶，还可以作用于DNA拓扑异构酶-DNA断裂复合物，来完成对拓扑异构酶活性的抑制，并最终导致细胞凋亡。抑制剂的作用实际上是使细胞内功能正常的拓扑异构酶转变为导致DNA链断裂的致伤物，而细胞死亡的最终原因可能是由于DNA链断裂的错误修复或是由于可断裂复合物的形成及稳定存在，激活了细胞内一系列导致细胞程序性死亡的过程。大体上来说，DNA拓扑异构酶抑制剂的抑制机理可以分为两种，一种是毒性机理，一种是催化抑制机理。毒性机理是指抑制剂与Topo-DNA共价复合物形成三元复合物，通过提高Topo-DNA共价复合物的稳态浓度使拓扑异构酶“中毒”。而催化机理是指抑制剂通过阻滞拓扑异构酶的某一特定功能或催化反应中的某一步骤，进而抑制拓扑异构酶总的催化活性。3.2抑制剂类型而对于拓扑异构酶抑制剂的类型，常用的有：有机小分子作为DNA拓扑异构酶抑制剂，因其作用的底物不同，可以分为TopoⅠ抑制剂、TopoⅡ抑制剂和TopoⅠ/Ⅱ双重抑制剂，而以TopoⅠ为靶点的抑制剂主要是喜树碱及其衍生物；以TopoⅡ为靶点的抑制剂则较多，根据与底物的作用方式不同，将拓扑异构酶Ⅱ抑制剂分为TopoⅡ毒剂和TopoⅡ催化抑制剂，但迄今发现的TopoⅡ抑制剂大部分为TopoⅡ毒剂，常见的有阿霉素(Doxorubicin)，VP-16(Etoposide)，沙尔威辛等；大部分TopoⅠ/TopoⅡ双重抑制剂是TopoⅠ和TopoⅡ的双重毒剂，能同时稳定两种拓扑酶与DNA形成的可断裂复合物，从而抑制拓扑酶的活性。还有金属配合物作为DNA拓扑异构酶抑制剂，与有机化合物相比，金属配合物分子结构具有更好的可塑性，容易在配体上引入其他分子活性基团，可以针对不同的底物结合环境进行相应的结构修饰;而且其丰富的光电磁性质将有助于探索某些复杂的生命过程。然而，虽然发现不少金属配合物具有识别和断裂DNA功能，但真正在DNA拓扑异构酶抑制方面的具体应用还非常少，至今仅有为数不多的关于金属配合物抑制DNA拓扑异构酶的研究报道，主要集中在铂类、钌类、金类等金属配合物方面。其次便是一些铂类配合物作为拓扑异构酶抑制剂，铂类配合物作为研究最早的抗肿瘤药物，一直备受研究者关注。钌类配合物作为拓扑异构酶抑制剂，钌多吡啶配合物具有既为刚性又带手性的八面体构型，水溶性比较好，热力学性质稳定，不易发生配体取代，易于在近生理条件下开展研究，光化学、光物理信息丰富，毒性低，细胞膜透性较好，但目前钌类配合物作为拓扑异构酶抑制剂的抗肿瘤，活性研究仅限于体外研究阶段，需要更进一步对其作用机理等进行详细的研究，以确定其作为抗肿瘤药物的临床可能性。当然，还有其他一些金属配合物作为拓扑异构酶抑制剂，除了铂、钌类金属配合物以外，常见的已用于抗肿瘤药物研究的还有金、镉、钴、镍等金属配合物，但是关于它们作为拓扑异构酶的抑制剂的报道则很少。4、展望从20世纪70年代发现DNA拓扑异构酶晶体结构至今，经过几十年的努力，人们已经研制出一系列的拓扑异构酶抑制剂作为有效的抗肿瘤药物应用于临床，并对其作用机理做了大量研究。随着肿瘤生物学及相关学科的发展，人们逐渐认识到细胞癌变的本质是细胞信号转导通路的失调导致的细胞无限增殖。研发的重点正在从传统的细胞毒药物转移到针对肿瘤细胞内异常信号系统靶点的特异性新一代抗肿瘤药物。而DNA拓扑异构酶作为抗肿瘤药物设计的重要靶标，便受到了许多研究者的关注。近年来以拓扑异构酶为靶点的抗癌药物如阿霉素、表阿霉素、VP16、VM26、喜树碱及其衍生物等，已成为临床化疗方案中的重要药物。但目前仍有许多问题尚待深入研究和探讨，比如多数拓扑异构酶有机抑制剂存在结构复杂、特异性不高、溶解性差、毒性较大等缺点;有关各类抑制剂与拓扑异构酶或（和）DNA的作用机制尚不明确;拓扑异构酶的某些生理功能还不是太确切;拓扑异构酶引起细胞凋亡过程中相关信号分子的作用、信号转导途径的调控机制及Topo抑制剂与信号网络的特异性等，抑制所完成的仅是全部过程中的一个必要起始步骤。所以，我们仍需更深一步的研究。5、其他发现不久之前，科学家发现，拓扑异构酶对“泛自闭症”有着一定的影响，研究称，一组被称为拓扑异构酶的酶系出现问题会对大脑发育的遗传机制产生重大影响，并可能导致自闭症谱系障碍（ASD）。选择性降低拓扑异构酶活性，会通过影响“转录伸长”降低“长基因”在小鼠和人类神经元中的表达。虽然很多ASD候选基因特别长，但已证实几种ASD候选基因的表达会被拓扑异构酶的抑制降低。这些发现表明，影响拓扑异构酶的化学物质和基因突变（也包括转录机构的其他部分）可能有助于ASD和其他神经发育疾病的发生。而这一研究或许能够最终解释大量的自闭症病例背后的生物学机制。6、结语DNA拓扑异构酶是近年来发现的肿瘤化疗的重要靶点。它涉及到抗癌作用的许多环节,如产生可切割的DNA复合物、干扰基因正常转录、抑制DNA合成等，同时还与肿瘤化学预防的靶点细胞诱导分化及蛋白激酶C有关。所以，拓扑异构酶抑制剂的研究，对定向治疗肿瘤有着重要的作用，其中金属配合物有着其独特的优势，我们应该投入更深一步的研究。此外,拓扑异构酶在抗药性、细胞突变及神经发育疾病中的重要作用亦不可忽视。