DNA提取2011.

讲课教师讲课标题组织DNA制备刘湘帆TissueDNAExtraction2009年3月上海交通大学医学院主要内容核酸提取总论1酚氯仿提取法基本原理2酚氯仿提取基本步骤32009年3月上海交通大学医学院一、提取DNA总的原则：1保证核酸一级结构的完整性；2其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；3核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；4其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。2009年3月上海交通大学医学院二、样本来源(Specimen)：理论上所有有核真核细胞、细菌、病毒都可以提取DNA样本选择取决于试验目的全血是基因组提取最常见的样本2009年3月上海交通大学医学院血清、血浆、外周血有核细胞、痰液、体液、棉拭子采集的各种分泌物、组织（包括骨髓）和羊水等都是分子诊断的检验材料，其中全血、血浆（血清）标本占分子诊断的60%以上2009年3月上海交通大学医学院DNA提取前样本采集、预处理和保存：（一）全血1.抗凝剂EDTA-Na2或枸橼酸钠作为抗凝剂不宜使用肝素抗凝剂处理血肝素柠檬酸*EDTA*-80℃保存2个月，第10天收率90%4℃第四天收率90%第10天提取效果差第十天收率85%室温提取效果差第四天收率90%第十天提取效果差2009年3月上海交通大学医学院（二）血浆和血清(plasmaandserum)血浆和血清是检测释放入血的游离核酸最主要的标本来源，用来检测病毒、细菌，以及肿瘤细胞等等释放出来的游离核酸和蛋白质产物，在临床上被广泛应用于病原微生物和肿瘤标志基因检测2009年3月上海交通大学医学院血浆DNA又称为循环DNA，是一种无细胞状态的胞外DNA，主要是游离的单链、双链DNA或DNA-蛋白质的混合物它在未来分子诊断的应用中具有广阔前景血浆DNA成分的来源分为内源性和外源性两个部分，其中入侵的病毒、细菌等病原体释放入血液的核酸是外源性血浆DNA最重要的成分2009年3月上海交通大学医学院血浆DNA(plasmaDNA)内源性循环DNA外源性循环DNA自身基因组来源DNA入侵的病毒、细菌等病原体死亡细胞活细胞释放2009年3月上海交通大学医学院（三）体液尿液、胸水、腹水和脑脊液等标本离心后取沉淀提取体液中细胞的核酸对释放入体液中的病毒或细菌的游离核酸，采用超高速离心或体液浓缩后再提取核酸2009年3月上海交通大学医学院（四）分泌物（以痰液为例）痰液是检测呼吸道病原体核酸的主要样本，深部咳痰，患者采集早晨起床后的第一口痰，采集前应先漱口，以避免混入大量的口腔脱落的上皮细胞和唾液等影响检测结果2009年3月上海交通大学医学院结核分枝杆菌的检测，可以用NaOH液化痰液去除粘液和蛋白质；非结核分枝杆菌的核酸，使用生理盐水后取上清液痰液检测病原体核酸不适宜作定量分析，检测时尽可能提高痰液中细胞成分的回收率2009年3月上海交通大学医学院三、DNA提取的基本步骤1、核酸的释放(DNArelease)：破裂细胞释放核酸机械法与非机械法（非机械法中溶胞法是应最广泛的方法）2009年3月上海交通大学医学院各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法应用Ⅰ机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母Ⅱ物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞Ⅲ化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母2009年3月上海交通大学医学院破裂细胞、释放核酸2009年3月上海交通大学医学院2、核酸的分离与纯化(isolationandpurity)：将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其他物质分离非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂类分子）、非需要的核酸分子、试剂和溶液2009年3月上海交通大学医学院3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤沉淀可去除部分杂质与某些盐离子加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤2009年3月上海交通大学医学院4、DNA鉴定(DNAidentification)DNA的鉴定浓度鉴定(concentration)纯度鉴定(purity)完整性鉴定(integrity)2009年3月上海交通大学医学院浓度鉴定(concentrationidentification)1）紫外分光光度法(ultravioletspectrophotometery)测定DNA在A260nm的光吸收值。A260×稀释倍数×50×1/光径＝μg/ml紫外分光光度法只用于测定浓度大于0.25ug/ml的核酸溶液。A值等于1时：相当于50μg/ml双链DNA40μg/ml单链DNA或RNA20μg/ml单链寡核苷酸2009年3月上海交通大学医学院各种碱基的紫外吸收光谱2009年3月上海交通大学医学院2）荧光光度法荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）2009年3月上海交通大学医学院EB与DNA的结合2009年3月上海交通大学医学院500l全血提取的基因组DNA电泳动物组织提取基因组DNA2009年3月上海交通大学医学院纯度鉴定(purityidentification)紫外分光光度法：在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。A260与A280之比应在1.80；纯的RNAA260与A280之比应在2.0。A260/A280比值是纯度检测的重要指标。2009年3月上海交通大学医学院完整性鉴定(integrityidentification)凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。2009年3月上海交通大学医学院2009年3月上海交通大学医学院5、核酸的贮存——DNA保存(storage)1）短期贮存：4℃或-20℃存放于TE（tris和EDTA）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。2）长期贮存：TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。2009年3月上海交通大学医学院主要内容核酸提取总论1酚氯仿提取法基本原理2酚氯仿提取基本步骤32009年3月上海交通大学医学院（一）酚抽提法：先用EDTA、SDS、蛋白酶K破碎细胞，消化蛋白，然后用pH8的Tris饱和酚或酚-氯仿抽提DNA，最后乙醇或异丙醇进行沉淀。获DNA大小为100－150kb。2009年3月上海交通大学医学院DNA酚抽提法示意图2009年3月上海交通大学医学院主要试剂的作用：EDTA：1二价金属螯合剂，抑制核酸酶；2降低细胞膜的稳定性2009年3月上海交通大学医学院SDS的作用：1、溶解膜蛋白和脂肪，从而是细胞膜破裂2、溶解核膜和核小体，使其解聚，将核酸释放出来3、对RNA、DNA酶有抑制作用4、与蛋白质形成R-O-SO3…R蛋白质复合物，使蛋白质变性2009年3月上海交通大学医学院蛋白酶K(protenaseK)：水解蛋白质的作用，消化DNA酶和细胞中的蛋白质蛋白酶K与其他蛋白酶相比，它具有更强的水解能力，而且在SDS、EDTA存在时仍保持较高活性，可同时使用2009年3月上海交通大学医学院苯酚(phenylhydroxide)的特点：蛋白质强变性剂、抑制DNA酶活性苯酚溶于有机溶剂，微溶于水提取DNA前苯酚用Tris-Hcl饱和，防止吸收过多DNA，降低DNA的损失率氧化苯酚会破坏DNA2009年3月上海交通大学医学院为什么苯酚要重蒸饱和后才能用于DNA的分离？苯酚在空气中经常被氧化生成醌，它能够产生自由基，直接用于DNA分离，会使磷酸二酯键断裂，造成DNA降解。氧化苯酚需要经过高温重蒸以除去氧化物，并用Ttis-Hcl饱和酚，并调节至中性。2009年3月上海交通大学医学院PH8.0的Tris溶液可以使抽提出的DNA进入水相，减少在蛋白质层滞留。在酚或酚-氯仿中加入少许的异戊醇，是可以减少实验中的气泡的产生，而且利于分相，保持分相的稳定性。2009年3月上海交通大学医学院DNA的沉淀1）无水乙醇沉淀(ethanol)沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。2）异丙醇沉淀(isopropanol)除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子2009年3月上海交通大学医学院（二）甲酰胺解聚法：破碎细胞同上，然后用高浓度甲酰胺解聚蛋白质与DNA的结合，再透析获得DNA。高浓度甲酰胺可以裂解蛋白质与DNA的复合物，可以使蛋白质变性。减少了酚多次抽提的步骤甲酰胺解聚法适用于从标本中制备高分子量的DNA样品。可得DNA200kb左右。2009年3月上海交通大学医学院（三）玻璃棒缠绕法：用盐酸胍裂解细胞，将裂解物铺于乙醇上，然后用带钩或U型玻璃棒在界面轻搅，DAN沉淀液绕于玻棒。生成DNA约80kb2009年3月上海交通大学医学院DNA玻棒缠绕法示意图2009年3月上海交通大学医学院DNA提取试验中常遇到的问题基因组DNA收率较低或无基因组DNA样本材料太少细胞破裂不够充分，DNA释放不完全离心力偏小两相分离不完全……2009年3月上海交通大学医学院DNA降解的原因样本不够新鲜，采集材料过陈旧样本本身存在大量DNA酶提取DNA的生物活性差的原因？提取的基因组DNA盐浓度过高基因组DNA中乙醇未清除净基因组DNA中可能存在其他抑制因素提取基因组DNA，有时加入蔗糖的原因加入多糖，保护DNA长度2009年3月上海交通大学医学院主要内容核酸提取总论1酚氯仿提取法基本原理2酚氯仿提取基本步骤32009年3月上海交通大学医学院实验步骤1、2.5ml兔肝组织匀浆，加入等体积苯酚-氯仿，旋紧缓慢颠倒混匀5min.2、2500rpm离心10分钟。3、取水相置干净离心管中。4、加入等体积氯仿-异戊醇,旋紧缓慢颠倒混匀5min.5、2500rpm离心10分钟。2009年3月上海交通大学医学院6.吸上清液至新离心管中，加入5mol/LNaCl至终浓度0.3mol/L,加入2.5体积冰无水乙醇，紧缓慢颠倒混匀，2500rpm离心10分钟，见白色沉淀。7.去上清，加入70%～75%乙醇洗涤，2500rpm离心5分钟。8.DNA沉淀溶解于1mlTE中，得到DNA原液。9.测定DNA浓度和纯度(1:5稀释)。