DNA测序原理.

第六章DNA序列分析人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)人类基因组计划(humangenomeproject,HGP)是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。总体计划在15年内投入至少30亿美元进行人类全基因组的分析。美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日本和我国科学家共同参与。我国承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30亿个碱基的测序任务。人类基因组线粒体基因组核基因组(约30亿个碱基)基因外序列基因和基因有关序列约10%约90%专一或中等重复序列Non-codingDNA假基因内含子基因片段10%90%专一的或低拷贝数序列中度至高度重复序列20~30%70~80%分散重复序列串联重复序列/成簇重复序列约60%约40%蛋白编码基因rRNA基因tRNA基因CodingDNA序列测定的技术杂交测序法质谱法单分子测序法原子探针显微镜测序法DNA芯片法经典方法:Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-GilbertDNA化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技术方法:•与PCR反应类似。•反应体系中包含：模板DNA,Taq酶,dNTPs,ddNTPs和测序引物；•反应过程：变性－复性－延伸－终止Sanger双脱氧终止法Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）•ddNTPs是反应终止剂可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接。•反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般3~4：1)。*少一个－OH脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较HSanger第一步：加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快ddNTPs参与下的DNA复制Sanger法测序产物的平均链长取决于ddNTP与dNTP的比例，比例高时，得到较短的产物；GelElectrophoresisDNAFragmentSizeDetermination•DNA带负电•DNA在电泳胶中的迁移率与其片段大小有关Sanger第二步：荧光检测除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。Maxam-Gilbert化学裂解法一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。碱基特异性化学切割反应：硫酸二甲酯（DMS）：使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N7原子甲基化。肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下，只C断裂，而不与T反应。哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。T+C反应：肼（低盐）C反应：肼（高盐）测定DNA长度~250bp。化学裂解法测定DNA的核苷酸序列DNA片断序列测定的策略测定未知序列的DNA片断一次测序结果有长度限制（﹤1000bp)通用引物指导未知序列的测定引物步移随机克隆测序缺失克隆测序通用引物指导未知序列的测定根据载体序列设计通用引物测定待测DNA片断引物步移策略将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。定向缺失克隆策略、染色体步查法等。鸟枪测序法(shotgunsequencing)：随机克隆测序将待测的DNA片段随机打断并构建随机重叠克隆文库，然后通过通用引物测定每个克隆中的待测DNA序列。当这些已测序列的数量达到一定程度后，相当于待测DNA片断的每一部位的序列也就被测定出来了，通过这些所测序列之间的重叠部分，最终可将整个DNA片断的序列拼接出来，这样的测序策略称为随机克隆测序。将DNA大片段切割成小片段的三种方法：限制性内切酶酶切超声波处理DNA酶I降解(加Mn2+)鸟枪法测序的缺点随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，造成重复测定，也易丢失某些序列，且数据处理分析工作量大。高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。完整基因组的测序过程一般包括三个步骤：（1）建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC（YeastArtificialChromosome）克隆、细菌人工染色体BAC（BacterialArtificialChromosome）克隆等；（2）利用鸟枪法（ShotgunStrategy）测定每个克隆的序列；（3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等，进而对序列的生物学特性进行注释。基因组测序DNA全序列切成小段小段和载体结合结合后进行测序MapfragmentsSequenceoverlappingfragmentsAssembledsequence基因组DNA序列测定示意图通过随机剪切得到的大分子DNA片段克隆到载体上。绘制出这些重叠片段的图谱，并对重叠片段进行测序，通过“拼装”得到基因组序列。另一种方法不是根据片段的染色体位置，而是根据其重叠部分进行“拼装”。Sequenceallfragmentsandassemble第四章作业：Southern、Northern、Western杂交、生物芯片技术、RNAi技术原理分别是什么？第五章作业：PCR克隆与一般的DNA片段的克隆有何异同点？第六章作业：1Sanger双脱氧终止法化学降解法进行序列分析的原理是什么？第七章作业：1DNA诱变种类有哪些，各有何特点？