DNA粗提取过程与蛋白质的提取分离PCR

专题5DNA和蛋白质技术课题1DNA的粗提取与鉴定广东广雅中学郑灿伟选用除了人或其他哺乳动物血液外、细胞容易破裂的生物组织，如菜花、鸡血、鱼卵等。什么样的材料适合提取DNA？提取DNA前必须破裂鸡血细胞，有什么简单的方法？细胞内DNA主要与什么物质结合？DNA+蛋白质染色体加蒸馏水，让鸡血细胞吸水涨破。广东广雅中学郑灿伟加入2mol/L的NaCl溶液，溶解DNA加蒸馏水根据上图原理，可以用什么方法将DNA提取出来？而与蛋白质等杂质分离开。为除去某些溶于2mol/LNaCl溶液的杂质，可以通过析出DNA的方法进行纯化，有效的办法是？将NaCl溶液浓度调为0.14mol/L，DNA析出0.14mol/L2mol/L溶解度NaCl浓度0.14mol/L2mol/L溶解度NaCl浓度DNA加冷酒精DNA不溶于酒精，某些蛋白溶于酒精广东广雅中学郑灿伟用甲基绿染液。结果丝状呈现绿色。DNA+二苯胺蓝色二苯胺二苯胺鉴定时需要什么条件？二苯胺遇DNA呈现什么颜色？对照组实验组沸水浴我们以前学过什么方法对DNA进行染色？DNA的鉴定广东广雅中学郑灿伟①搅拌时动作要轻缓且朝一个方向②10ml二苯胺A+2滴二苯胺B充分混匀分装2试管(4ml)2层纱布过滤多层纱布过滤留滤液留黏稠物20ml40ml20ml搅拌1min搅拌3min沿内壁缓慢加入，至黏稠物不再增加2层纱布过滤留滤液5ml溶液+4ml二苯胺水浴锅加热5min40ml实验过程5ml对照组和实验组快速搅拌5min5ml广东广雅中学郑灿伟124573(1)步骤1之前，收集到的鸡血往往要加入柠檬酸钠，为什么?防止鸡血凝固过滤过滤过滤6广东广雅中学郑灿伟(2)步骤1和步骤3中加入蒸馏水有什么不同?步骤1：使鸡血细胞吸水涨破。步骤3：稀释NaCl溶液浓度,使DNA析出,去杂质112244557733过滤过滤过滤过滤过滤过滤66广东广雅中学郑灿伟112244557733过滤过滤过滤过滤过滤过滤66(3)步骤3中如果不断加入蒸馏水，起初会有DNA析出，但到了后来析出物略微有所减少，为什么？不断加入蒸馏水，DNA溶解度先变小后增大0.14mol/L2mol/L溶解度NaCl浓度0.14mol/L2mol/L溶解度NaCl浓度DNA广东广雅中学郑灿伟112244557733过滤过滤过滤过滤过滤过滤66(4)步骤34和步骤45都需要过滤，有什么不同?步骤34：除去溶解的杂质，获得DNA析出物。步骤23：除去不溶解的杂质，获得DNA溶解液。溶解DNA析出DNA广东广雅中学郑灿伟(5)在步骤5中，要析出丝状DNA，除了可以通过加入95%的酒精外，还可以用什么方法达到这一目的？加蒸馏水，将NaCl浓度降至0.14mol/L112244557733过滤过滤过滤过滤过滤过滤66广东广雅中学郑灿伟(6)步骤3和5中两次析出DNA，依据的原理是否相同？步骤3：DNA在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低步骤5：DNA不溶于酒精，沉淀析出112244557733过滤过滤过滤过滤过滤过滤66广东广雅中学郑灿伟(7)步骤2、4和6共有三次使用到2mol/LNaCl溶液，其目的是否相同？相同，都是为了溶解DNA112244557733过滤过滤过滤过滤过滤过滤66广东广雅中学郑灿伟0.14mol/L2mol/L溶解度NaCl浓度0.14mol/L2mol/L溶解度NaCl浓度DNA材料的选取破碎细胞，获取滤液去除杂质2mol/LNaCl析出与鉴定①加入预冷95%的酒精②加入2mol/L的NaCl③沸水浴+二苯胺0.14mol/LNaCl+蒸馏水+柠檬酸钠+蒸馏水(溶解DNA，除去不能溶解的杂质)(析出DNA，除去溶解的杂质)(析出DNA)(溶解DNA)(变蓝色)操作过程广东广雅中学郑灿伟专题5DNA和蛋白质技术课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段广东广雅中学郑灿伟5‘端3‘端5‘端3‘端1链2链广东广雅中学郑灿伟单链DNA（脱氧核苷酸链）引物DNA复制方向的示意图A代表什么？D代表什么？引物模板的3’端广东广雅中学郑灿伟PCR技术（聚合酶链式反应）（1）原理DNA双链复制（碱基互补）（3）条件模板DNA(目的基因)酶：热稳定DNA聚合酶(Taq酶)引物：DNA（2）原料4种脱氧核苷酸高温变性低温复性中温延伸（4）过程广东广雅中学郑灿伟专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离原理P64广东广雅中学郑灿伟凝胶原理过程•分子量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢。•分子量大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。凝胶色谱法(分配色谱法)根据蛋白质之间的分子大小、吸附性质等差异进行纯化。多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。(分子筛效应)广东广雅中学郑灿伟在本课题中使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能。作用缓冲溶液在一定范围内，抵制抵制外界酸和碱对pH溶液影响，维持pH基本不变。血液pH维持恒定与HCO3-、HPO42-等缓冲物质有关。广东广雅中学郑灿伟带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。利用各种分子带电性质、分子大小等的不同，在电场作用下迁移速度不同，各种分子得以分离。琼脂糖凝胶电泳；聚丙稀酰胺凝胶电泳原理电泳类型聚丙稀酰胺凝胶电泳•由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS作用下解聚成单条肽链•SDS与蛋白质结合使其带上负电，掩盖原蛋白质间的电荷差别●电泳迁移率完全取决于肽链分子的大小。●分子量小迁移快；分子量大迁移慢。广东广雅中学郑灿伟●红细胞的洗涤目的：得到纯净的红细胞（去掉血浆蛋白等物质）方法：低速离心加再离心……●血红蛋白的释放方法：加_______、甲苯，让红细胞破裂生理盐水蒸馏水样品处理样品处理粗分离纯化凝胶色谱法电泳法鉴定广东广雅中学郑灿伟小分子可以通过，大分子不能通过。●分离血红蛋白溶液方法：高速离心●透析——除去样品中相对分子量较小的杂质。粗分离纯化凝胶色谱法电泳法鉴定广东广雅中学郑灿伟DNA指纹图谱M示母亲，C示儿子，F1－F4示待测男性电泳技术可在外电场作用下，把待测分子的混合物放在一定的介质（如琼脂糖凝胶）中进行分离和分析或用作亲子鉴定。右图是DNA指纹图谱技术的电泳结果，下列判断错误的是A．提取DNA时，可用冷酒精B．据指纹图谱，分析F2最有可能是该小孩真正的父亲C．DNA指纹图谱技术要用到限制酶D．DNA指纹图谱技术不能应用于人类基因组测序广东广雅中学郑灿伟生理盐水缓冲液快