EDU_细胞增殖检测

荧光显微镜检测方法(以96孔板，A549贴壁细胞为例)细胞培养取对数生长期细胞，以每孔4×103~1×105细胞接种于96孔板中，培养至正常生长阶段。药物处理(可选)客户可以根据实验需要进行各种药物处理。EdU标记1.1用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液(试剂A)，制备适量50μMEdU培养基；注：1)EdU浓度与孵育时间相关，短时间孵育(2h)宜采用高浓度(10~50μM)，长时间孵育(24h)宜采用低浓度(1~10μM)；2)如果需配置10μMEdU培养基，需调整为5000：1稀释比例；3)配置好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。表1EdU培养基及染色反应液的使用量参考96孔板*48孔板24孔板12孔板6孔板5.5cm小皿EdU培养基100μl150μl200μl300μl500μl2mL染色反应液100μl150μl200μl300μl500μl2mL注：1)*表示贴壁细胞通常采用的培养容器，EdU培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜；2)悬浮细胞EdU用量依据培养体积而定。1.2每孔加入100μL50μMEdU培养基孵育2小时，弃培养基；注：1)最佳孵育时间与细胞周期相关(表2)，大多数细胞系均可采用2小时孵育时间；2)EdU培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证EdU孵育时间内的营养物质持续供给(表1)；1.3PBS清洗细胞1~2次，每次5分钟。注：清洗目的是将未渗入DNA的EdU洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁不牢的细胞请降低清洗强度。表2EdU孵育时间设定参考3T3HelaHEK293*细胞系人胚胎细胞酵母细胞人成纤维细胞人宫颈癌细胞人胚肾细胞系人神经细胞细胞周期~30min~3h~18h~21h～25h~5d孵育时间5min20min2h2h2h1d注：1)EdU孵育时间取决于细胞周期，一般为细胞周期的1/10至1/5，但大多数细胞系均可采用2h孵育时间。孵育时间越长，细胞增殖数量就越多；2)*考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，具体实验的细胞群体细胞周期会有所变化。表3细胞实验EdU孵育浓度及时间参考PubMedIDReferenceCelllineConcentrationTime18272492SalicA,etal.PNAS.2008NIH3T3,Hela10nM~10μM1hr18521918CappellaP,etal.CytometryA.2008HL-60,A2780,U2OS1~10μM30min18996411ChehrehasaF,etal.JNeurosciMethods.2009Neurospheres1~20μM24hr19179371LimsirichaikulS,etal.NucleicAcidsRes.2009Primaryfibroblasts10μM1,2,4hr19253396WarrenM,etal.DevDyn.2009Chickembryos10μM~2mM4hr19647746YuY,etal.JImmunolMethods.2009Spleencells50μM24hr19544417MomcilovićO,etal.StemCells.2009HumanEScells10μM30min20080700CinquinO,etal.PNAS.2010emb-301μM12hr20025889HanW,etal.LifeSci.2009VSMC50μM2hr20659708HuangC,etal.JGenetGenomics.2010ESC50μM2hr21310713HuaH,etal.NucleicAcidsRes.2011fissionyeaststrains10μM3hr20824490LvL,etal.MolCellBiochem.2011EJcells50μM4hr21248284YangS,etal.BiolReprod.2011GCcells50μM2hr21227924ZhangYW,etal.NucleicAcidsRes.2011U2OS,HT2930μM90min21829621GuoT,etal.PloSOne.2011HIT-T1550μM4hr21980430ZengT,etal.PloSOne.2011MCF-10A25μM2hr22012572DingD,etal.IntOrthop.2011C3H10T1/210μM24hr22000787ZengW,etal.Biomaterials.2011EPC50μM4hr21913215XueZ,etal.JCellBiochem.2011SGC790125μM24hr22016038PengF,etal.LasersMedSci.2011MSC50μM2hr21878637LiD,etal.JBiolChem.2011HCC50μM2hr注：如果您有采用BrdU进行实验的经验，可以参照BrdU实验的相关参数进行EdU实验。细胞固定化2.1每孔加入50μL细胞固定液(即含4%多聚甲醛的PBS)室温孵育30分钟，弃固定液；注：1)低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，当需要抗体染色时，需采用TritonX-100透化细胞以利于抗体进入细胞内。2)可采用其他方式进行细胞固定。2.2每孔加入50μL2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液；注：目的是中和多聚甲醛，保证染色反应体系，当采用其他方式进行细胞固定时可酌情省略此步骤；2.3每孔加入100μLPBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS；2.4(加强)每孔加入100μL渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床孵育10分钟;PBS清洗1次，5分钟。注：当实验需要进行其他抗体染色时，或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高，可能需要增强细胞膜通透性。普通细胞可以省略。Apollo染色3.1每孔加入100μL的1XApollo®染色反应液(表3)，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；注：1)染色液用量与细胞量相关，以覆盖细胞为宜(表1)；2)孵育时间可以进行适当调整，调整范围为10~30分钟。表4Apollo®染色反应液的配置参考(现用现配)配制顺序Apollo®染色反应液500μL*1mL5mL10mL1去离子水469μL938μL4.69mL9.38mL2Apollo®反应缓冲液(试剂B)25μL50μL250μL500μL3Apollo®催化剂溶液(试剂C)5μL10μL50μL100μL4Apollo®荧光染料溶液(试剂D)1.5μL3μL15μL30μL5Apollo®缓冲添加剂(试剂E)5mg9mg44mg88mg注：1)*表示通常配制的Apollo®反应液的体积足以进行5～10个孔(96孔板)染色；2)按顺序配制适量1XApollo®染色反应液，以免破坏正常的反应体系(现用现配，30分钟用完)；3)试剂E为白色粉末，较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需更换；粉末较难准确称量，称量误差范围可稍微放宽，但不应超过±20%。3.2加入100μL渗透剂(0.5%TritonX-100的PBS)脱色摇床清洗2~3次，每次10分钟，弃渗透剂；3.3(加强)每孔每次加入100μL甲醇清洗1~2次，每次5分钟；PBS清洗1次，每次5分钟。注：由于某些细胞对染料的吸附性较高，需采用加强方式洗脱以降低染料背景。普通实验可以省略。DNA染色4.1用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1XHoechst33342反应液，避光保存；4.2每孔加入100μL1XHoechst33342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液；4.3每孔每次加入100μLPBS清洗1~3次；4.4客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入100μLPBS保存待用。其他染色(自备)(可选)客户可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色(注：染料兼容性请参照表4)。图像获取及分析建议染色完成后立即进行观测;如果条件限制，请避光4℃湿润保存待测，但不应超过3天。注：调试仪器时，请将曝光时间调整为30ms左右，尽量不要1s。表5配套染料的相关波长信息C00031*Apollo®567550nm565nmCy3C00041Apollo®643653nm667nmCy5C00033*Hoechst33342350nm461nmDAPI注：1)*荧光显微镜宜采用Hoechst33342及Apollo®567进行DNA复制活性检测；2)激光共聚焦显微镜采用Apollo®567或Apollo®643均可。