EGCG对EAE实验方案

EGCG对EAE实验方案一、实验材料1、实验动物：C57BL/6雌性小鼠，7-9周龄2、实验试剂：MOG35-55CFA结核杆菌H37Ra百日咳毒素医用一次性三通管，医用玻璃注射器IL-17、IL-23、IFN-γ、TNF-α、IL-17A、IL-6，IL-4、TGF-β、IL-33ELISAkit一、EAE造模1、小鼠购买后，饲养于室温22~26℃，湿度为52~56％的环境中，维持明——暗循环交替，并给予充足的食物和水。每日于同一时间称量小鼠并记录。适应性饲养一周后用于实验。2、用0.01mol/LPBS将MOG35-55稀释为60mg/ML,然后加入等体积的CFA混合，用电动搅拌器充分搅拌乳化，直至乳化液滴入水中成油包水状。放置与4°C保存12h。3、称量小鼠体重，按0.1毫升/20g予以1%戊巴比妥钠麻醉，腹腔注射。再将油包水状抗原乳剂接种于小鼠脊柱两侧皮下，分四个部位，每个部位50微升，分别于免疫后第0及三天腹腔内注射百日咳500ng。二、途径1、机制：IL-6、TGF-β协同诱导IL-17促进IL-23，RORγt（调控IL-17mRNA的表达，是Th17细胞分化的关键性转录因子）的表达，从而利于Th17细胞的分化（产生后永久性存在），在IL-23的支持下分泌Th-17产生炎症效应（破坏血脑屏障，导致CNS炎症，杀死神经元细胞，轴突受损）.假设EGCG可以上调CD4细胞上HO-1基因的表达，即上调HO（血红素加氧酶），HO-1可以抑制IL-6，阻止Th17细胞分化。需测指标:脊髓中IL-17、IL-23、HO-1的mRNA水平。（实时定量PCR）。外周血液中IL-6、IL-7浓度（ELISA检测）。2、机制：①caspase-9是凋亡细胞的关键。假设EGCG能通过抑制cyt-c释放至细胞质，减少caspase-9的激活，进而降低线粒体途径凋亡的发生，发挥神经保护作用。②抗氧化反应元件NRF2是具有基本亮氨酸拉链结构的一种核转录因子。能抑制线粒体电传递链破坏造成的神经毒性，使小鼠对线粒体电子链复合物1、2更敏感，在神经组织中NRF2通路的激活可对抗线粒体复合物1抑制剂鱼藤酮和线粒体复合物1抑制剂3-硝基丙酸引起的线粒体应激，发挥神经保护作用。需测指标及方法：①westernblot检测线粒体凋亡通路特异性标记蛋白caspase-9的表达②westernblot检测线粒体凋亡通路关键蛋白cyt-c的表达③westernblot检测各组小鼠脊髓NRF2的表达④免疫组化检测各组小鼠NRF2的表达.3、机制：已有研究显示中枢神经系统高表达IL-33，且IL-33可诱生Th2型细胞因子，从而导致Th1/Th2细胞偏离，发挥保护作用。在本课题中我们可假设EGCG能够增强IL-33分泌，从而对EAE疾病进程产生保护作用。3.1检测指标首先借助逆转录PCR、实时定量PCR、western-blot、免疫组化检测正常小鼠、EAE小鼠及注射EGCG的EAE小鼠的脑、脊髓、肝脏IL-33表达水平及改变，用ELISA检测上清IFN-γ、IL-17、TNF-α水平。4.机制：Th1主要分泌IFN-γ,在炎症初期诱导募集Th17,启动炎性反应。假设EGCG对该途径有抑制作用，检测指标：IL-17A,IL-6mRNA的表达情况（实时荧光定量RT-PCR）IL-17A,IL-6,INF-γ(ELISA试剂盒)5.机制：Treg和Th17是两个在CD4T细胞分化过程中相互抑制的两个不同亚群，Treg主要分泌IL-10和TGF-β,可同时抑制Th17/Th1所介导的炎症反应。假设EGCG可以调控CD4T细胞分化成Th17/Th1或Treg的平衡，或诱导Treg表达Foxp3(转录因子)抑制Th17的分化。检测指标:IL-17A,IL-6，Foxp3mRNA的表达情况（实时荧光定量RT-PCR）脾淋巴细胞CD4+CD25+Treg/CD4+T的比例（流式细胞术）外周血IL-17,IL-4（ELISA试剂盒）Foxp3蛋白质的检测（westernblot）6.机制已有研究证明ICA（淫羊藿苷，中药）具有雌激素样作用，通过影响E2和ER的水平来缓解EAE的临床症状。ICA通过雌激素途径增加TGF-β水平发挥抗炎作用。①抑制对IL-2依赖的T细胞增殖；②抑制IL-2依赖的B细胞分泌IgM；③抑制细胞因子TNF-α产生。在实验之前假设EGCG也有雌激素样作用，可以促进小鼠体内雌激素分泌。检测指标：①放射免疫法检测各组小鼠内源性雌激素E2水平。②ELISA检测小鼠血清中TGF-β水平。三、方法及试剂1、制作小鼠脊髓冰冻片免疫荧光1.1灌注固定，组织取材，切片①取正常小鼠，腹腔注射0.25%戊巴比妥钠0.2ml/10g。②仰卧位固定小鼠，75%酒精消毒腹部，暴露心脏，用医用输液器针头（黑色）从左心尖插入同时剪去右心耳，PBS快速冲洗1—2分钟。③待肝脏、肺部发白后快速换至4％多聚甲醛灌注此时刻观察到小鼠尾部由于灌注翘起随着灌注的进行全身僵硬灌注大约持续15—20分钟。④灌注结束后，将小鼠包好放置冰箱内5—10分钟。⑤小心取出小鼠的脊髓至4％多聚甲醛后固定24小时。⑥固定结束后在20％的蔗糖（20g蔗糖溶于100mlPBS）溶液中脱水待脊髓沉至蔗糖溶液底部即可。⑦取小鼠脊髓胸腰节断，冰冻切片机切片，本实验切片微米，切片后脊髓置于多聚赖氨酸包被的玻片上4℃冰箱保存。1.2冰冻切片免疫荧光⑧将切片置于PBS染缸内放置10分钟。⑨加0.5％TritonX-10050微升破膜15分钟（若免疫染色不涉及胞内分子，此步骤可以省略）。⑩3％BSA封闭，37度2小时。（11）加一抗，一抗稀释液可以用3％BSA。一抗四度过夜。（12）PBS洗三次每次5分钟，加二抗37°2小时。（13）PBS洗三次每次五分钟。（14）50％甘油封片，激光共聚焦显微镜下观察。2脊髓石蜡切片HE染色及免疫组化2.1组织固定：取灌注固定后的脊髓组织，浸泡于4%多聚甲醛固定。2.2组织脱水、透明、浸蜡及包埋：组织固定以后，按以下步骤梯度脱水、组织透明和浸蜡及包埋处理2.3石蜡切片制作2.4HE染色(1)切片在二甲苯中脱蜡5-10分钟。(2)置二甲苯和纯酒精（1:1）混合液中约5min；(3)置100%、95%、85%、70%酒精各2~5min。最后经蒸馏水转入染液；(4)苏木精染色约5~10min：(5)洗去玻片上多余的染液，0.5~1%盐酸酒精（70%酒精配制）分色片刻。镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰可见为止，约数十秒；(6)流水冲洗15~30min，或在碳酸锂饱和液中短时间碱化或蓝化，即细胞核呈蓝色；(7)蒸馏水短洗；(8)0.1~0.5%伊红染液染色1~5min，若染色困难，可在每100ml染液中加1~2滴冰醋酸，使易着色并且不易脱色；(9)依次经70%、85%、95%、100%酒精脱色各2~3min，在95%以下浓度的酒精中伊红易脱色，应该适当缩短时间；(10)二甲苯透明（二次），共约10min；封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿使其干燥，迅速滴加适量中性树胶，在加盖玻片封固。2.5免疫组化3.实时定量R-TPCR检测mRNA相对含量3.1小鼠总各组织RNA提取3.2实时定量PCR4.流式细胞仪检测脾脏细胞CD4+CD25+Foxp3+Treg表达5.Westernblot