2实验二凝集沉淀反应

实验二凝集、沉淀反应实验目的1.熟悉凝集反应、沉淀反应的概念。2.了解单向琼脂扩散实验的原理、方法及应用。3.掌握直接凝集反应玻片法的原理、方法及其用途。4.掌握双向琼脂扩散实验的原理、方法、结果判断。1.直接凝集反应：颗粒性抗原与相应抗体结合后所呈现的肉眼可见的凝集现象。。2.沉淀反应：可溶性抗原与相应抗体在适当条件下结合而出现的沉淀现象。实验原理伤寒杆菌诊断血清、伤寒杆菌菌液、生理盐水、载玻片、接种环、记号笔、酒精灯；琼脂板、打孔器、针头、毛细滴管、待测血清、AFP阳性血清、AFP诊断血清（兔抗人AFP）等。实验材料实验内容1.直接凝集反应：玻片法（操作）2.沉淀反应：（1）单向琼脂扩散试验（示教）（2）双向琼脂扩散试验（操作）抗原抗体反应又称血清学反应，主要有：1、凝集反应2、沉淀反应3、补体参与反应4、中和反应5、免疫标记技术常见抗原抗体反应的种类一、凝集反应(一)概念颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应。颗粒性Ag又称凝集原相应Ab又称凝集素原理玻片凝集试验是一种快速简便的检测方法，即抗原抗体的反应在玻片上进行，是一种定性的试验。用已知抗体检测未知抗原。本试验用已知的伤寒杆菌标准诊断血清鉴定未知细菌。直接凝集反应玻片法--菌种鉴定材料伤寒杆菌诊断血清、伤寒杆菌菌液、生理盐水、载玻片、接种环、蜡笔、酒精灯等。取洁净玻片1张，用蜡笔划分2等份，如下图所示；无菌操作，用接种环分别于一、二格内各加2～3环伤寒杆菌诊断血清、生理盐水；用接种环取待测菌液，分别涂布于生理盐水和伤寒血清中，混匀；轻轻摇动玻片，1~2分钟后观察结果。操作步骤生理盐水＋待测菌液阴性伤寒血清＋待测菌液？直接凝集反应玻片法--菌种鉴定盐水侧无凝集颗粒；血清侧出现肉眼可见的凝集块为阳性，仍为均匀一致乳浊液者为阴性。注意事项1、接种环在伤寒菌液取菌前后均需严格灭菌，以免出现假阳性。2、注意涂菌时，先涂生理盐水侧，以免污染血清产生错误结果。3、摇动玻片时不要把两凹内液体混在一起。结果及判断直接凝集反应玻片法--菌种鉴定经典抗原抗体反应的一种。分类:琼脂扩散环状沉淀反应絮状沉淀反应免疫电泳二、沉淀反应:沉淀线或沉淀环可溶性抗原相应抗体+琼脂扩散试验：琼脂是一种含有硫酸基的多糖体，高温时溶于水，冷却后凝固，形成凝胶，呈多孔结构，充满水分，允许各种抗原抗体分子自由扩散。二者于比例适当处相遇，发生沉淀，形成可见的沉淀带。单向琼脂扩散实验:仅抗原或抗体扩散——定量实验双向琼脂扩散实验:抗原和抗体同时扩散——定性实验分类：（一）单向琼脂扩散试验（示教）原理:适宜浓度的抗体预先在琼脂中混匀后制成琼脂板，以适当距离打孔，将可溶性抗原至孔中，抗原向周围扩散，与琼脂中抗体相遇，抗原与抗体比例适宜时，出现沉淀。沉淀环的直径与孔中抗原浓度呈正相关，可根据沉淀环直径大小从预先绘制成的标准曲线查出待测标本中抗原含量。本试验方法简单，容易观察结果，可测定抗原的灵敏度约为10～20μg／ml.应用:人血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量检测。单向琼脂扩散实验:抗原浓度沉淀环直径平方AgAgAgAg琼脂中含抗体1:101:201:401:80Ag未知（二）双向琼脂扩散试验（操作）原理:将可溶性抗原与相应抗体两种溶液置于琼脂糖凝胶的不同位置，使两者在凝胶中各自向四周扩散,抗原与抗体相遇并在比例合适处形成可见的乳白色沉淀线。应用:检测AFP、HBsAg,协助疾病诊断.材料：待测血清、AFP阳性血清、AFP诊断血清（兔抗人AFP）、生理盐水、琼脂板、打孔器、针头、毛细滴管、酒精灯。双向琼脂扩散法测血清中AFP甲胎蛋白（AFP）：是一种在胚胎期由肝细胞和卵黄囊合成的α球蛋白，存在于胎儿血清中，出生后血清中AFP几乎消失。正常成人血清中仅含极微量的AFP，经典的免疫学方法检测不出。当肝细胞发生癌变时，AFP含量增高，测血清中AFP，可协助诊断原发性肝癌。1、制备琼脂板：1%盐水琼脂加热溶化，取5ml均匀铺与载玻片上。2、打孔：琼脂凝固后，用打孔器打孔成梅花型，针头取出孔中琼脂。3、封底：用酒精灯轻烤平皿底部至琼脂刚刚要熔化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。4、加样：中间孔加抗AFP抗体，1、4孔加AFP阳性对照，2、3孔加待检血清，5、6孔加生理盐水。5、反应：于湿盒，37C24h。抗AFP抗体123456123456双向扩散法测血清中AFP操作步骤AgAgAg?Ag?Ab3421561、4两孔（阳性对照孔）与中心孔之间应出现清晰的乳白色沉淀线，5、6（阴性对照孔）两孔与中心孔之间无沉淀线。3421562、3两孔（待测血清）如与中心孔之间也出现了沉淀线，且一端与相邻的阳性对照血清形成的沉淀线相吻合，则该待测血清为阳性。如待测血清与中心孔出现了沉淀线，但与阳性对照血清的沉淀线相交叉，不判为阳性。如待测血清24h内与中心孔间无沉淀线则为阴性。双向扩散法测血清中AFP实验结果1、琼脂板一定平整、光滑(无气泡)，琼脂不可过厚；2、打孔不要划破边缘；3、加样要加满而不溢出为止；4、合理分配吸管，Ag、Ab吸管不能混淆。双向扩散法测血清中AFP注意事项凝集反应与沉淀反应的比较凝集反应沉淀反应抗原性质颗粒性或可溶性抗原致敏颗粒可溶性反应时间几分钟数小时至数天反应产物凝集块沉淀物思考题1、凝集反应的原理及直接凝集反应玻片法的用途是什么？2、沉淀反应的原理是什么？作业1写出实验报告2分析凝集反应的结果和意义3绘出双向琼脂扩散试验结果图