环境微生物学实验指导书

环境微生物学实验指导书王华主编江西农业大学国土资源与环境学院2007年10月2目录微生物实验须知……………………………………………………………3实验一显微镜使用与细菌染色法………………………………………5实验二放线菌与霉菌形态观察…………………………………………10实验三污水环境细菌运动性与原生动物、藻类的形态观察…………11实验四微生物的大小测定与数量的测定………………………………12实验五培养基的制备与灭菌……………………………………………16实验六环境微生物的分离与生理鉴定实验……………………………18实验七环境微生物分离与生理鉴定结果检查…………………………22实验八水中总大肠菌群的测定－多管发酵法…………………………243微生物实验须知微生物学实验课的目的是：训练学生掌握微生物学最基本的操作技能；了解微生物学的基本知识；加深理解课堂讲授的某些微生物学理论。同时,通过实验,培养学生观察、思考、分析问题和解决问题的能力；实事求是、严肃认真的科学态度以及勤俭节约、爱护公物的良好作风。为了上好微生物学实验课,并保证安全,特提出如下注意事项：1．每次实验前必须对实验内容进行充分预习,以了解实验的目的、原理和方法,做到心中有数,思路清楚。2．认真及时做好实验记录,对于当时不能得到结果而需要连续观察的实验,则需记下每次观察的现象和结果,以便分析。3．实验室内应保持整洁,勿高声谈话和随便走动,保持室内安静。4．实验时小心仔细,全部操作应严格按操作规程进行,万一遇有盛菌试管或瓶不慎打破、皮肤破伤或菌液吸入口中等意外情况发生时,应立即报告指导教师,及时处理,切勿隐瞒。5．实验过程中,切勿使酒精、乙醚、丙酮等易燃药品接近火焰。如遇火险,应先关掉火源,再用湿布或沙土掩盖灭火。必要时用灭火机。6．使用显微镜或其他贵重仪器时,要求细心操作,特别爱护。对消耗材料和药品等要力求节约,用毕后仍放回原处。47．每次实验完毕后,必须把所用仪器抹净放妥,将实验室收拾整齐,擦净桌面,如有菌液污染桌面或其他地方时,可用3%来苏尔液或5%石炭酸液覆盖其上半小时后擦去,如系芽孢杆菌,应适当延长消毒时间。凡带菌之工具(如吸管、玻璃刮棒等)在洗涤前须浸泡在3%来苏尔液中进行消毒。8．每次实验需进行培养的材料,应标明自己的组别及处理方法,放于教师指定的地点进行培养。实验室中的菌种和物品等,未经教师许可,不得携出室外。9．每次实验的结果,应以实事求是的科学态度填入报告表格中,力求简明准确,并连同思考题及时汇交教师批阅。10．离实验室前应将手洗净,注意关闭门窗、灯、火、煤气等。5实验一显微镜使用与细菌染色法一、实验目的1．学习掌握显微镜的结构、功能和使用方法。2．学习掌握细菌简单染色和革兰氏染色方法。二、显微镜的结构与功能1．显微镜的结构显微镜有机械装置和光学系统两大部分组成。机械装置主要作用是使光学系统，紧固在一个光轴直线上，而且可精确地调节各光学系统部件之间的距离，使显微镜产生清晰的物象。其组成包括：①镜座和镜臂；②镜筒；③物镜转换器；④载物台；⑤调焦装置（粗调节器和细调节器）。光学系统使显微镜最主要地部分，起分辨和放大目的物地作用。其组成包括：①目镜；②物镜；③集光器；④反光镜；⑤光源（自然光源和电光源）。光学显微镜基本结构：1.照明灯(Lamp)2.聚光器(Condenser)3.载物台和切片夹(Mechanicalstageandspecimenretainer)4.推进器(Mechanicalstageadjustmentknob)5.物镜(Objectives)6.粗细螺旋(Courseandfinefocusknob)7.目镜(Oculars)8.照相机等接口(Connectiontocamera,etc.)62．显微镜的成像原理标本得到足够的照明由标本反射或折射出的光线经物镜进入使光轴与水平面倾斜45度的棱镜，在目镜的焦平面上，即在目镜的视场光阑处，成放大的侧光实像，该实像在经目镜的接目透镜放大成虚像，所以人们看到的实虚像。3．分辨力与数值孔径显微镜的光学技术参数包括：数值孔径、分辨率、放大率、焦深、视场宽度、覆盖差、工作距离等等。这些参数并不都是越高越好，它们之间是相互联系又相互制约的，在使用时，应根据镜检的目的和实际情况来协调参数间的关系，但应以保证分辨率为准。71．数值孔径数值孔径（又称开口率numericalaperture简写NA）是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径是光线投射到物镜上的最大开口角度一半的正弦，乘上标本与物镜间介质的折射率的乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2成正比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率n值。基于这一原理，就产生了水浸物镜和油浸物镜，因介质的折射率n值大于1，NA值就能大于1。2．分辨率显微镜的分辨率是指能被显微镜清晰区分的两个物点的最小间距，。其计算公式是σ=λ/NA式中σ为最小分辨距离；λ为光线的波长；NA为物镜的数值孔径。可见物镜的分辨率是由物镜的NA值与照明光源的波长两个因素决定。NA值越大，照明光线波长越短，则σ值越小，分辨率就越高。要提高分辨率，即减小σ值，可采取以下措施（1）降低波长λ值，使用短波长光源。（2）增大介质n值以提高NA值（NA=nsinu/2）。（3）增大孔径角u值以提高NA值。（4）增加明暗反差。83．放大率和有效放大率由于经过物镜和目镜的两次放大，所以显微镜总的放大率应该是物镜放大率和目镜放大率的乘积。显然，和放大镜相比，显微镜可以具有高得多的放大率，并且通过调换不同放大率的物镜和目镜，能够方便地改变显微镜的放大率。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好。显微镜放大倍率的极限即有效放大倍率。分辨率和放大倍率是两个不同的但又互有联系的概念。当选用的物镜数值孔径不够大，即分辨率不够高时，显微镜不能分清物体的微细结构，此时即使过度地增大放大倍率，得到的也只能是一个轮廓虽大但细节不清的图像，称为无效放大倍率。反之如果分辨率已满足要求而放大倍率不足，则显微镜虽已具备分辨的能力，但因图像太小而仍然不能被人眼清晰视见。所以为了充分发挥显微镜的分辨能力，应使数值孔径与显微镜总放大倍率合理匹配。4．镜头的识别低倍、高倍和油镜接物镜的识别方法，可直接读它上面刻的倍数，简便方法是低倍镜较短，高倍镜较长，油镜更长且上面刻有黑圈。使用时一定要识别清楚，不可认错，否则在转换物镜时会碰压镜头，损坏物镜的危险。放大倍数越高的接物镜它的焦距越小，工作距离也越小，因此油镜观察时镜头和玻片极为接近，使用时应该注意。9三、实验方法1．用枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）作简单染色：涂片→干燥→固定→染色→镜检（1）涂片：在玻片中央滴一滴蒸馏水，然后取菌少许，洗入蒸馏水滴中，做成薄薄一层。（2）干燥：细菌涂片一般应让他自然风干。有时为使它干得快些，可以把涂片小心在酒精灯火焰上微微加热烘干。（3）固定：细菌涂片常用火焰固定法。即将涂片不快不慢地在火焰上通过2-3次，菌体受热固着于玻片上。（4）染色：细菌简单染色常用石炭酸复红或草酸铵结晶紫为染色剂。在已固定的涂片上加一大滴石炭酸复红染色液，使盖住整个涂抹面，静置染色1分钟。（5）水洗：染色完毕用自来水把玻片上的染色液冲洗干净。（6）镜检：将染色片晾干，或用吸水纸把多余的水吸去晾干，再用显微镜观察。2．用大肠杆菌(E.coli)和金色葡萄球菌(staphylococcuaaureus)作革兰氏染色:染色方法的要点及原理：先用结晶紫染色，再加碘液固定，酒精处理后用番红复染。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。染色的具体步骤：涂片→固定→初染→媒染→脱色→复染→镜检（1）取菌按常法涂片、干燥、固定。（2）草酸铵结晶紫染色1分钟。（3）充分水洗后加碘液处理1分钟。（4）水洗后酒精脱色15-20秒。（用酒精连续滴洗，至不溶出颜色为止）。（5）水洗后加番红染色1分钟。（6）充分水洗，吸去余水后晾干，镜检。四、作业1．画出你在油镜下观察到的细菌形态并注明放大倍数？2．在染色中，固定一步起何作用？酒精脱色一步为何是关键？3．用油镜观察应注意哪些问题？滴加香柏油起什么作用？4．油镜使用完后应如何处理？10实验二放线菌与霉菌形态观察一、实验目的1．学习掌握插片法和水浸片法观察放线菌和霉菌的方法。2．学习掌握低倍镜和高倍镜观察丝状菌体的技能。二、实验内容1．用插片法观察绘图放线菌的形态并注意“三丝”分化。将灭菌的盖玻片斜插在涂布放线菌孢子的培养基的平板上，一半露在外面，恒温培养后在培养基表面和盖玻片上部都有放线菌生长，小心取出盖玻片，放在干净的载玻片上，在显微镜下直接观察。2．用水浸片法观察：青霉（Penicillium.sp）、曲霉（Aspergillus.sp）的形态和分生孢子。根霉（Rhigopus.sp）的假根和孢囊孢子。梨头霉（Absidia.sp）的接合孢子，木霉（Trichederma.sp）的形态，注意分枝形态。霉菌菌丝一般可从培养体上直接调取，作成水浸片。具体方法：在清洁载玻片中央，加蒸馏水一滴，用解针挑取少量菌丝放入水滴中，这时两手各持针一支，将菌丝分开，不使缠结成团。挑开菌丝后，轻轻加上盖玻片，注意不要产生气泡，先用低倍镜后用高倍镜观察。三、作业1．绘图、记录南昌链霉菌、青霉、木霉、曲霉和根霉的形态。2．绘图、记录梨头霉的接合孢子形态。3．用水浸片法观察丝状真菌应注意哪些事项？11实验三污水环境细菌运动性与原生动物、藻类的形态观察一、实验目的1．学习掌握用悬滴法观察细菌运动性的方法和技术。2．学习掌握用水浸片法观察原生动物和藻类的形态。二、实验内容1．用悬滴法观察污水中细菌的运动性，注意运动方向。2．用水浸片法观察原生动物的形态、运动性并注意分类。（1）鞭毛虫类（Flagellata）：绿眼虫、波豆虫（2）肉足虫类（Sarcoclina）：变形虫、太阳虫（3）纤毛虫（Ciliata）：草虫、肾形虫、钟虫、豆形虫、漫游虫等3．用水浸片法观察藻类的形态、种类并注意分类。（1）绿藻：空球藻属（Fudoria）珊藻属（Scendesmus）鼓藻属（Cosmarium）小球藻属（Chlorella）盘星藻属（Pediastrum）（2）裸藻：眼虫藻属（Euglena）（3）硅藻：舟形藻属（Navicula）直链藻属（Melosira）平板藻属（Tabellaria）三、作业1．绘图记录细菌的运动方向，悬滴法观察应注意哪些事项？2．绘图记录原生动物、藻类的形态、种类和名称。12实验四微生物的大小测定与数量的测定一、实验目的1．学习了解测微尺的结构，掌握测定微生物大小的方法。2．观察酵母菌的形态，掌握鉴别死活酵母菌的方法。3．学习了解血球计数板的结构，掌握微生物数量测定的方法。二、实验内容1．在低倍镜和高倍镜下求出目镜测微尺的校正值。（1）目镜测微尺和镜台测微尺目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片的中央刻有一小尺，它是在5毫米内作50等分刻制的，每一等份为0.1毫米。另一规格是5毫米作100等分，每等分为0.05毫米。镜台测微尺是刻在载玻片中央的小尺，它是在1毫米内作100等分刻成的，每等分10微米。（2）目镜测微尺校正的方法将镜台测微尺上面的透镜片取下，把目镜测微尺放在光阑上，刻度朝下。把镜台测微尺置于载物台上，用低倍物镜检视，使测微尺位于视野中央。注意区分视野内两把尺哪个是目镜测微尺，哪个是镜台测微尺。利用推进器或转动目镜使两尺的第一条13线（0线）互相重合，然后找出另一条重合线。如重合线较多选取距0线最远的重合线。记下两条重合线之间两尺的刻度，依公式算出目镜测微尺的校正值。目镜测微尺校正值（每刻度微米数）=两重叠刻度间镜台测微尺格数×10两重叠刻度间目镜测微尺格数2．用美兰水浸片法观察酿酒酵母（saccharomycescerevisiac）的形态，注意出芽繁殖和死活酵母菌