4-1化学发光免疫分析技术

化学发光免疫分析Contents化学发光免疫的基本概念化学发光剂和标记技术化学发光免疫分析的类型123电化学发光免疫4化学发光免疫的基本概念11.1化学发光的基本原理发光：是指分子或原子中的电子吸收能量后，由基态（较低能级）跃迁到激发态（较高能级），然后再返回到基态，并释放光子的过程。根据形成激发态分子的能量来源不同可分为:光照发光、生物发光、化学发光等。生物发光的本质是化学发光化学发光原理：伴随化学反应的光发射现象某些物质在进行化学反应过程中，由于吸收了反应产生的化学能而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光，这种吸收化学能使分子发光的过程称为化学发光(Chemiluminescence，CL)。1.1化学发光的基本原理化学发光分析•根据化学发光反应在某一时刻的发光强度或反应的发光总量来确定反应中相应组分含量的分析方法，称为化学发光分析。化学发光分析优点•化学发光具有荧光的特异性，同时不需要激发光，就避免了荧光分析中激发光杂散光的影响有很高的灵敏度，•并且不象放射分析那样存在强烈的环境污染和健康危害，是一种非常优秀的定量分析方法。化学发光分析缺点•虽然化学发光具备很高的特异性和很小的干扰，但化学分析本身的不特异性，制约了整个方法的使用。化学发光免疫分析Chemiluminescenceimmunoassay(CLIA)化学发光免疫学特异性强敏感性高简便、快速重复性好1.2化学发光的种类直接化学发光一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。反应过程可简单地描述如下：A+BC*+DC*C+h11.2化学发光的种类间接化学反应发光若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子F上，使F分子激发到电子激发态，F分子从激发态回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。反应过程可表示如下：A+BC*+DC*+FF*+CF*F+h2化学发光效率决定于生成激发态产物分子的化学激发效率（φCE）和激发态分子的发射效率（φEM）。化学发光反应的发光效率、光辐射的能量大小以及光谱范围，完全由发光物质的性质所决定，每一个发光反应都具有其特征性的化学发光光谱和不同的化学发光效率。1.3化学发光的效率化学发光剂和标记技术22.1化学发光剂概念在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形式释放能量的化合物，称为化学发光剂或发光底物。化学发光剂选择条件：①发光的量子产率高；②物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配；③能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物；④其化学发光常是氧化反应的结果；⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。直接化学发光剂直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。2.2化学发光剂种类直接化学发光剂，间接化学发光剂A.吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。代表性物质：光泽精(lucigenin)NCH3NCH3++.2NO3-OxidationOH-NOCH3*NMA+LIGHTLucigeninN-METHYLACRIDONE(NMA)氧化剂：H2O2还原剂：乳酸尿酸抗坏血酸催化剂：过渡金属离子、酶抑制剂：酚类物质对此反应有抑制作用间接测定：能够生成H2O2的基质及相应的酶max=445nm量子产率高，易于标记，是发展化学发光免疫分析和DNA发光探针的重要标记物B.三联吡啶钌三联吡啶钌[RU(bpy)3]2+是电化学发光剂，它和电子供体三丙胺（TPA）在阳电极表面可同时失去一个电子而发生氧化反应。三联吡啶钌酶促反应发光剂：利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光，这一类需酶催化后发光的发光剂称为酶促反应发光剂。A．鲁米诺及其衍生物B．AMPPD间接化学发光剂A.鲁米诺及其衍生物鲁米诺发光原理B．AMPPD〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕A.碳二亚胺（EDC）缩合法2.3发光剂的标记B.过碘酸钠氧化法C．重氮盐偶联法D.N-羟基琥珀酰亚胺活化法1．发光剂的选择2．被标记蛋白质的性质3．标记方法的选择4．原料比5．标记率6．温度2.4影响发光剂的标记的因素化学发光免疫分析的类型3用化学发光剂（吖啶酯或鲁米诺类）直接标记抗体(抗原)，与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-化学发光剂标记抗体复合物，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱性环境，化学发光剂在不需要催化剂的情况下分解、发光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内所产生的光子能，这部分光的积分与待测抗原的量成正比，可从标准曲线上计算出待测抗原的含量。3.1直接化学发光免疫分析发光磁微粒被测抗原+抗体+带吖啶酯标记物抗体冲洗后（1）加入H2O2（pH10）（2）加入碱（pH10）直接化学发光的机理（夹心法）化学发光酶免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。3.2化学发光酶免疫分析该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。3.2.1辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析辣根过氧化物酶标记化学发光免疫分析示意图3.2.1辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。3.2.2碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析碱性磷酸酶标记化学发光免疫分析示意图3.2.2碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析分析步骤分配样品,磁颗粒和试剂孵育，使反应物结合在磁场中清洗去除未结合物质加入底物产生信号孵育,促使信号的产生信号检测电化学发光免疫4FlowcellFeOxidizedReducedElectrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA20世纪80年代出现，90年代用于临床检测。ECLIA电化学免疫学化学发光发光特点：联吡啶钌（标记物+三丙胺自由基（催化）+三角形脉冲电压（激发），0.01ms就可发出稳定的光。优点：1.灵敏度高（联吡啶钌再循环），2.检测步骤简化（游离/结合）3.可实现多元检测4.可实现自动化•在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记Ab，通过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定性。电化学发光免疫分析Electrochemiluminescenceimmunoassay，ECLIA电化学发光、免疫分析检测、生物素-抗生素、固相磁珠技术电化学发光剂•定义：指通过在电极表面进行电化学反应而发出光的物质。•特点–反应在电极进行–化学发光剂：三联毗啶钌–电子供体为：三丙胺（TPA）NNNNNNRuOONOO•ECL分析中采用[Ru(bpy)3]2+作为标记物，其活化衍生物是[Ru(bpy)3]2+＋N羟基琥珀酸胺酯（NHS），该衍生物具有水溶性，且高度稳定，保证电化学发光反应的高效和稳定，而且避免了本底噪声的干扰。三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+特点•[Ru(bpy)3]2+衍生物与免疫球蛋白结合的分子比超过20仍不会影响抗体的可溶性和免疫活性；•[Ru(bpy)3]2+分子量小，空间位阻小，即便小分子的核酸也能标记，使检测的样品种类大大丰富，更重要的是为其检测样品种类的开发前景提供了广阔空间。三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+特点1电化学反应2化学发光3循环+常用方法类型•固相磁性微球吸附采用的固相载体是带有磁性的直径约2.8μm的聚苯乙烯微粒。其特点是反应面积比板式扩大20－30倍，吸附效率高；在液体中形成均匀的悬液，参与反应时类似液相，反应速度大大加快；•链霉亲和素-生物素吸附“链霉亲和素-生物素”是是具有很强的非共价相互作用的一对化合物，具有牢固而特异的结合，应用此放大系统，使检测的灵敏度大大提高亲和素—糖蛋白；生物素-维生素HECLIA检测流程图一（双抗体夹心的形成）ECLIA检测流程图二（生物素与亲和素结合）ECLIA体系结构图ECLIA检测流程图三（磁珠吸引吸附于电极表面）ECLIA检测流程图四（电极充电启动电化学反应）ECLIA检测流程图五（撤消磁场冲洗磁珠）电化学发光免疫测定示意图•高度敏感，可达pg／ml或pmol水平；•特异性强，重复性好，CV＜5％。•测定范围宽，可达7个数量级。•试剂稳定，无毒害，无污染，有效期长，达数月甚至数年。•操作简单，耗时短，易于自动化。•在对环保很重视的国家，CLIA成了取代RIA的首选方法。ECLIA的优越性临床应用•激素•肿瘤标记物•内分泌功能•传染性疾病•其它–如VB12、叶酸、铁蛋白、肌钙蛋白、肌红蛋白、酶、脂肪酸、维生素和药物等多种检测项目。小结：化学分析的特点不需要外部光源：消除了入射光的干扰(瑞利散射和拉曼散射)。克服了光源不稳定而导致的波动的缺点，降低了噪声，提高了信噪比。灵敏度高(通常可达ng级或pg级)。线性范围宽(通常可达三个数量级)。设备简单、分析快速、易实现自动化。局限性：方法选择性较差、发光体系相对较少、仪器商品化不够