4分子杂交及基因芯片技术

第四章分子杂交及基因芯片技术（molecularhybridization）杂交类型•Southern,Northern,Western,Dot,colony(plaque)采用的方法•印记转移（blotting）过程•变性(denature)：热，极端pH，有机溶剂，尿素•杂交(hybridization)：同源单链重新配对恢复成双链为杂交4.1SouthernBlotting1977年，Southern发明了一种检测DNA分子的方法，将琼脂糖凝胶电泳上的DNA片段转移到硝酸纤维素滤膜上，再进行同源杂交，寻找有同源性的DNA分子。杂交过程Southern印记转移分子杂交EdwinSouthernSouthern印记转移目的DNA琼脂糖凝胶电泳0.4mol/LNaOH变性成单链1.5MNaCl、1MTris（pH7.4）中和，保持单链通过毛细管渗吸、电转移、真空等方法转移至硝酸纤维素膜或者尼龙膜紫外线照射固定DNA转移buffer：6×SSC(orSSPE)时间:1kb1hr,15kb18hr一般情况２－３hr滤纸凝胶滤膜吸水纸玻璃板重物支持物500g预杂交滤膜,掩盖滤膜上非特异性位点•变性鱼精DNA；3-12小时让探针与同源DNA片段杂交,然后漂洗除去非特异性结合的探针•混合滤膜、探针、杂交液；6-12小时通过显影检查目的DNA所在的位置•X光片上曝光;1-2天杂交探针•是一段核酸片段，对它进行标记以后，可以通过分杂交来探测核酸样品中与之同源的ＤＮＡ片段。探针种类•ＤＮＡ（单双链）•ＲＮＡ探针标记物•放射线：３２Ｐ、３３Ｐ•非放射线：地高辛（ＤＩＧ）4.2分子探针探针检测•放射性：Ｘ－光片显色•地高辛：酶联免疫法探针标记方法均匀标记•切口平移标记•随机引物标记•ＰＣＲ扩增标记末端标记•末端补平•末端置换•末端转移切口平移标记DNApolymeraseI随机引物KlenowFragmentＰＣＲ扩增标记Tagpolymerase末端补平KlenowFragmentT4/T7polymeraseAGGTTCTGC-5’5’-TCGAGTACAGGTTCTGC-3’5’-TCGAGTAC3’-AGCTCATGTCCAAGACG-3’dNTP*3’端标记末端置换t4polynucleotidekinaseT4多聚核苷酸激酶T4polynucleotidekinase5’端标记末端转移末端转移酶TerminalTransferase3’端标记地高辛（ＤＩＧ）显色原理Roche公司（德国）dUTP－11C－ＤＩＧDNA/RNA-DIGDIG＋Antiboy-ALP底物是5-溴-4-氯-3吲哚酚磷酸盐(BCIP)浓紫色沉淀M，地高辛（DIG）标记的分子量标准（λDNA/HindⅢ）；1-3，苏云金芽胞杆菌YBT-1520菌株的总DNA分别经KpnⅠ－PstⅠ、PstⅠ和KpnⅠ酶切。以cry1Aa杀虫晶体蛋白基因中的728bp片段作探针，通过随机引物标记的方式，用DIG标记探针。结果显示，该菌株至少含有两个杀虫晶体蛋白基因，而且其拷贝数明显不同。预示至少其中一个基因位于多拷贝的质粒上。4.３NorthernBlotting类似于Southernblotting用于检测RNA的分子杂交技术，用于分析总RNA或mRNA在操作的过程中包括ＲＮＡ的提取、电泳过程等等，要时刻注意避免ＲＮＡ的降解，具体的操作请参考《分子克隆实验指南》以及最新的文献。Northernblot检测上皮因子在人体不同器官的表达情况4.４WesternBlottingWestern杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。基本原理同其它blot方式，关键区别在于探针性质：抗体(antibody)•1.单克隆抗体(monoclonalantibody)：并非都适合，由于靶蛋白已变性。•2.多克隆抗体抗体为混合物，对其特异性，亲和力及浓度都一无所知对由SDS/还原剂变性处理的目标蛋白是否还能识别应做预备实验。简要步骤SDS-PAGE蛋白质转移：电转移封闭背景：脱脂奶粉5%第一抗体与靶蛋白结合：免疫球蛋白二级免疫反应：羊抗兔免疫球蛋白抗体显色反应：辣根过氧化物酶（HRP,horseradishperoxidase）•与3.3-二氨基联苯胺作用形成棕色沉淀，钴或镍可加深颜色。碱性磷酸酶（ALP,alkaliphosphatase）•地高辛标记显色一致。与BCIP/NBT作用显紫色。放射自显影•125I蛋白质印记转移+-杂交示意图海拉癌细胞株蛋白CDK7的WesternBlot检测4.5其他分子杂交原位杂交(colonyinsituhybridization)•细菌从平板影印到硝酸纤维素滤膜上，然后将滤膜上的菌落原位裂解释放DNA，将DNA烘干固定于膜上与标记探针杂交，放射自显影检测菌落杂交信号、并与平板上的菌落对位。斑点杂交(dothybridization)•是将被检标本点到膜上，烘烤固定。4.6基因芯片技术定义：通过平面微加工技术在固体芯片表面构建微流体分析单元和系统，以实现对细胞、蛋白质、核酸以及其他生物组分的准确、快速、大信息量的检测。4.6.1生物芯片技术的历史1989年英国科学家Southern申请了有关在固体表面进行DNA杂交的专利。这是有关基因芯片的第一个专利。1992年世界上第一块原位合成基因芯片在美国Affymetrix公司诞生。1995年世界上第一块微矩阵基因芯片在美国斯坦福大学实验室诞生。1997年世界上第一张全基因组芯片——酵母芯片完成(斯坦福大学Brown实验室)。它含有6116个基因。TheFullYeastGenomeonaChip4.6.2生物芯片的特征与优点微型化高通量—提高信息量平行化—提高信息的可比性微量化—降低待检样品用量自动化—提高工作效率低成本—可迅速普及推广4.6.3基因芯片的分类根据分析对象可分为：•细胞固定技术•DNA芯片技术•蛋白质芯片技术根据芯片制作材料及方法可分为：•Array•Microarray•chip•MicroelectronicarrayArray用尼龙膜作固体支撑表面，将目标基因DNA排列在膜的表面并固定。杂交方法与常规Southern杂交相同。即mRNA反转录32P或33P标记的cDNA作探针进行杂交。这种方法经典，稳定，但密度低，8×12cm的膜可点4×384=1536个基因。ExpressiondecreasedExpressionincreasedBMinghui63leaf:nopathogeninoculationMinghui63leaf:inoculatedwithMagnaporthegrisea,V86013for5daysAABMicroarray用经特殊处理的玻璃片（载玻片）作固体支持表面，将目标基因DNA排列在玻片表面并固定。探针采用多色荧光标记。其特点是，密度高、制作方便，是目前应用最广泛的基因芯片之一。1cm2可以固定3000-10000个点。DNAchip（Affymetrix公司)在玻璃或朔料表面经光化学处理，运用固相合成技术在固体表面直接合成各种不同的寡聚核苷酸（一般为20bp）。探针采用多色荧光标记。其特点是，密度可高达40万个寡核苷酸/1.6cm2。原位合成芯片示意图第二十轮合成AAGcGT第一轮合成AGAGcT第二轮合成cGTTGGcGTcGTTGGAGAAGAAAccGGGccTTGGAAcTMicroelectronicarray运用集成电路控制电极，使电极与目标DNA分子结合。自动化程度高，具有极高的发展前景。制作工艺复杂、点样密度低。Nanogen公司4.6.4水稻基因芯片实例标记的方法通常是在反转录的底物中加入标记基团的核苷酸单体，通过反转录将标记分子掺入cDNA分子探针中。标记底物：dUTP替代物Cy3、Cy5Cy3-AP3-dUTP:Ex.550nmEm.570nmCy5-AP3-dUTP:Ex.649nmEm.670nm芯片结果的读取目前绝大多数生物芯片采用荧光染料标记，因此主要介绍荧光染料标记的生物芯片扫读装置。生物芯片常用多色荧光标记，最常用的是双色荧光标记。生物芯片扫读：•单通道读取•多通道读取分析软件Imagene4.2、Genepix杂种F1父母本总RNA总RNACy5-标记Cy3-标记混合水稻cDNA芯片杂交cDNA芯片分析技术流程图