4肝铜试验诊断意义.

杨旭教授简介•杨旭教授，主任医师，博士生导师，原中南大学湘雅二医院感染科主任、湖南省肝病学专业委员会主任委员、湖南省传染病学专业委员会副主任委员。1981研究生毕业，1990在美国留学3年。90年代起从事肝病的临床、教学和科研，重点研究肝豆状核变性，亲自诊治肝豆状核变性590余例，患者来自全国各地25个省市（含香港），建立了肝铜测定、基因诊断、快速驱铜等一整套诊疗新方法，诊断准确率99.0%，治疗有效率95%，出版肝豆状核变性专著1部，论文30余篇。•杨教授即将报告的关于肝铜研究的论文已被“Hepatology”接受，已在网上发表，即将在杂志上发表，这是肝铜研究领域具有里程碑意义的论文。肝铜试验诊断意义的前瞻性研究中南大学湘雅二医院肝病研究中心杨旭唐晓鹏张永红罗开忠等一、研究背景和目的研究背景•肝豆状核变性（Wilsondisease,WD）是重要的遗传性疾病，1912年Wilson首先详细地描述本病•四十年代发现铜的蓄积是本病的原因，1948年Cuming证实肝、脑铜含量升高•1968年Smallwood在柳叶刀杂志报告在一些肝病中的肝铜含量，证实WD肝铜显著增高，提出诊断WD的标准是≥250μg/g干重研究背景•但是，以后有多篇论文报告一些典型WD肝铜少于250μg/g干重•2005年Ferenci等发表肝铜研究论文，包括114例WD，219例其他肝病，提出按常规标准，肝铜试验的敏感性83.3%，最佳临界值为≥75μg/g。这一标准后来被美国和欧洲WD指南引用，也被许多论文引用•为什么差别这么大？原因不清楚存在的问题•2003年我院在国内率先建立的肝铜测定方法，检查了许多病人。根据我们自己的临床观察，我们感到现有肝铜的诊断标准与实际不完全相符。•为此，我们系统地复习了几乎所有的肝铜文献，发现肝铜研究存在几个突出的问题。存在的问题•1、尽管肝铜试验是WD最重要的的诊断试验，但是其方法没有标准化。•2、以前的研究表明，肝铜的分布是不均匀的。但是，一般用部分肝活检组识测定肝铜，这种方法可能因为取样误差而影响测定结果。•3、所有肝铜研究都是回顾性，没有前瞻性的。•4、所有肝铜研究所包括的病例少，病种少，缺少大样本、多病种研究研究目的•建立一个简便、可靠的肝铜测定方法（这是研究肝铜试验的诊断意义的前题）•采用前瞻性、多病种、大样本的方法评估我们设计的肝铜测定方法的可靠性•探讨肝铜试验的最佳诊断标准、敏感性、特异性、阳性和阴性预测值二、研究方法研究设计•设计概要：前瞻性队列研究•时间：2007年6月—2015年5月•地点：中南大学湘雅二医院肝病中心•纳入标准：可疑WD患者、WD患者的亲属需要肝活检者、其它各种需要进行肝活检者。•排除标准：有肝活检禁忌者、不愿进行肝活检者、WD患者驱铜治疗超过6月、肝组织小于1mg干重WD诊断标准•根据美国和欧洲WD指南：典型神经症状、铜蓝蛋白降低、K-F阳性、尿铜升高•根据2003年国际WD会议提出的计分诊标准：≥4，诊断WD•不典型病例、疑难病例根据长期临床观察结果•总之，要确保WD诊断准确无误肝铜测定方法•B超定位，每人穿刺2针，用1条完整的肝活检组织测定肝铜•将肝组织置于白纸上，迅速用针头将肝组织卷成一小团•将存有肝组织的纸片置于自制的67℃干燥箱2小时，彻底干燥•用万分之一分析天平（METTLER梅特勒E电子天平）准确称取总重（纸+肝），用干净的小刀片将肝组织刮下，置于1.5ml塑料瓶，再称取纸片的重量，即可获得肝组织的重量。肝铜测定方法•将肝组织送专门实验室，采用浓硝酸+过氯酸（4：1）150℃消化，用火焰原子吸收光谱法测定铜含量。•采取三大措施减少测量误差，确保测定结果准确可靠：•肝组织的处理全部由我完成•专业实验室、同一技术人员测定肝铜•每批实验都设有对照肝组织，与待测肝标本平行测定肝铜统计分析•所用统计分析都是用SPSS软件完成•定量和定性指标分别用T试研和卡方试验进行显著性测定•肝铜试验的诊断意义用敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、ROC表示（受试者工作特征性曲线）。用ROC计算最佳临界值三、结果病人入组情况•总肝活检人数：3350•2次肝活检及肝铜测定人数：714•排除例数：23•有效例数：691•总活检例数用于肝活检的安全性分析•总有效例数用于肝铜试验诊断意义分析各种肝病肝铜含量•疾病种类例数肝铜含量（250μg/g干重）•肝豆状核变性178770.6±393.2•WD杂合子24110.7±51.8•PBC&PSC48318.2±299.7•病毒性肝炎19850.1±35.3•AIH5082.1±66.0•脂肪肝4040.4±28.1•GS&DS2837.3±19.7•……………………………………………..诊断意义•WD肝铜均值显著高于其他任何肝病•除外PBC和PSC，按常用的诊断标准（≥250μg/g.干重）•敏感性：94.4%•特异性：96.8%•阳性预测值：91.8%•阴性预测值：97.8%诊断意义•亚型分析：•肝型的敏感性：100%•儿童型的敏感性：100%•ROC显示最佳临解值：209μg/g.干重•以209μg/g.干重为诊断标准：•总敏感性：99.4%•总特异性：96.1%影响肝铜含量的因素•男女WD患者肝铜无显著性差异•肝组织炎症和纤维化程度肝铜含量无影响•儿童肝铜显著性高于成人肝铜•神经型肝铜显著低于其他表型肝重对肝铜测定的影响•肝重(mg)例数平均肝铜变异系数(%)•1.0~1.522618.476.0•1.6~2.046856.351.0•2.1~2.540710.951.8•2.6~3.037829.941.0•≥3.133800.439.2肝活检的并发症•活检后可出现短暂、局部或右肩部不适、疼痛，两组无差异•少数患者出现短暂低血压、肝包膜局部血肿，两组无差异，不需特殊处理•1例并发气胸（肝穿1次），内科处理好转•无肝活检引起的死亡病例四、讨论肝铜测定的难点•有创检查，有一定风险•标本微小，干重仅0.5~3.5mg•肝铜分布不均匀，样本越少，取样误差越大•操作步骤多：活检、干燥、称量、消化、光谱分析等，任何一步都有可能造成测量误差，影响测定结果•测定方法未标准化减少测量误差的关键措施•1、用1条完整的肝组织而不是部分肝组织，以减少取样误差•2、肝组织置于小片白纸上干燥、称重，由于皮重很小，可减少称重的误差•3、铜含量测定是在经国家质量验正认可的专门实验进行•4、干燥及称重全部是我做的，铜含量测定全部由同一技术人员做的，减少操作误差•5、每次检测设计对照，平行检测，观察是否存在系统误差影响肝铜测定的因素•以前认为肝纤维化，特别是肝硬化是影响测定结果的关键因素，往往把阴性结果归因于肝硬化所引起的肝铜分布不均•本研究证明，性别、肝脏炎症程度、肝纤维化程度对肝铜测定并无影响•肝铜含量的变异系数随肝重增加而减少（1-1.5mg,CV:76.0%;3.0-3.5m,CV:39.1%)。肝组织的多小是影响测定结果的关键因素肝铜试验的诊断标准•68年提出的标准：≥250μg/g.干重。仅仅根据少数WD和其他病人得到的•2005年提出的标准：≥75μg/g.干重。依据：回顾性研究，用部分肝组织测定肝铜，114例WD，219例其他病人•新标准：≥209μg/g.干重。依据：前瞻性研究，用整条肝组织测定肝铜，178例WD，513例其他病人，病种多•相信我们的标准更符合实际肝铜试验的诊断意义•旧标准(≥250μg/g.干重)•敏感性：94.4%•特异性：96.8%•新标准(≥209μg/g.干重)•敏感性：99.4%•特异性：96.1%•肝铜试验是诊断WD最有价值的试验重要发现之一•肝铜沉积的理论：铜最早在肝脏沉积，超过其最大负荷后溢出，在头部及其他组织沉积。按这一理论，神经型的肝铜应最高。•一个未曾预料到的发现是，许多单纯神经型WD肝脏病例完全正常，其平均肝铜显著低于其他表型，甚至低于无症状者•这一发现可能具有重要的理论意义。我们提出，体内铜的沉积不都是从肝脏开始的重要发现之二•从理论上来说，如果不治疗，WD患者体内的铜不断增加，因此，高龄患者肝铜应高于低龄患者。•另一未预料的发现是儿童WD的平均肝铜显著高于成人。可能的机理是：•1、铜的蓄积不仅与年龄有关，更与WD突变的严重性有关：突变越重，铜沉积越快，发病越早。儿童患者突变一般更严重，所以铜更高•2、WD动物模型表明，肝铜沉积在出生几月后到高峰，数月后逐践降低，这种现象可能与机体逐践发展了不依赖于WD基因的铜平衡机制有关。肝铜试验的特殊意义•1、是确诊不典型肝型WD（铜蓝蛋白正常或轻度降低，K-F环阴性，或尿铜正常）最可靠的依据，敏感性100%，阴性可排除WD•2、是确诊儿童WD最可靠的依据，敏感性100%，阴性可排除WD。我们已解决幼儿肝活检的技术问题。•3、是鉴别WD和其他原因所致神经症状的最可靠的依据，有时甚至是唯一依据肝铜试验的特殊意义•4、肝活检加肝铜是鉴别WD和WD杂合子最可靠的依据，有时甚至是唯一依据•5、是鉴别病毒性肝炎和病毒性肝炎合并WD的最可靠的依据，有时甚至是唯一依据•6、是鉴别WD性脂肪肝和非酒精性脂肪肝最可靠的依据，因为两者肝铜差异极为显著肝铜试验的局限性•1、有创试验，有一定禁忌症•2、其它原因引起的慢性胆汁淤积也可引起肝铜升高，甚至与WD一样高。•典型PBC，PSC，家族性进行性肝内胆汁淤积等一般不会与WD混淆•不典型PBC，PSC和其它不明原因肝病引起肝铜升高，可误诊WD隐原性肝铜升高•10年来，我们遇见10例来自全国各大医院介绍来的病例：•北京、重庆、四川、吉林、广西、江西、湖南等地•患者均经过系统检查，原因不明，肝铜都很高，其中5例WD计分超过WD诊断标准。经过长期观察，排除WD鉴别方法•1、K-F和尿铜：两者都可异常，鉴别意义不大•2、肝铜：两者均可升高，无法鉴别•3、WDscore：有较大意义，但少数胆汁淤积可≥4•4、铜蓝蛋白：意义大，胆汁淤积很少降低•5、GGT、ALP：胆汁淤积多升高，WD极少升高（儿童仅ALP升高）诊断要点•1、对于肝铜升高的患者，必须考虑隐源性胆汁淤积的可能性•2、对于铜蓝蛋白正常或轻度降低、GGT和ALP升高5倍以升的患者，诊断WD要特别慎重•3、如不能排除WD，可试用驱铜治疗。如治疗6月~12月无明显好转，排除WD五、结论•1、我们设计的肝铜测定方法是可靠的•2、肝铜试验是非常有价值的诊断方法，其最佳临界值：≥209μg/g.干重）•敏感性：99.4%，特异性：96.1%•3、肝型和儿童WD的敏感性100%，阴性可排除WD•4、对于肝铜升高患者，要考虑隐源性胆汁淤积可能性