生物催化技术考试总结

第一章绪论•工业生物技术•定义：在工业规模的生产过程中使用或部分使用生物技术来实现产品的制造，这种技术是应用微生物和生物催化剂来提供产品和服务.•核心目标：大规模利用生物体系（如细胞或酶）作为催化剂实现物质转化.工业生物技术是生物技术的重要组成部分第一章绪论•工业生物技术发展空间提升传统产业生物能源环境生物技术生物材料第一章绪论•生物催化（Biocatalysis)•利用酶或有机体（细胞或细胞器等）作为催化剂实现化学转化的过程。生物转化（Biotransformation)•氧化-还原酶催化氧化-还原反应。•主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。•如乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。(1)氧化还原酶OxidoreductaseCH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADH•转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。(2)转移酶TransferaseCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHO•水解酶催化底物的加水分解反应。•主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。•例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：(3)水解酶hydrolaseH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OH•裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。•主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。•例如，延胡索酸裂合酶催化的反应。(4)裂合酶LyaseHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH•异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(5)异构酶IsomeraseOCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOH•合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。•A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi•例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2草酰乙酸(6)合成酶LigaseorSynthetase(四)活性部位和必需基团必需基团：这些基团若经化学修饰使其改变，则酶的活性丧失。活性部位：酶分子中直接与底物结合，并和酶催化作用直接有关的部位。必需基团活性部位维持酶的空间结构结合基团催化基团专一性催化性质酶作用的专一性结构专一性立体异构专一性族（基团）专一性绝对专一性(五)酶作用的专一性族专一性：可作用于一类或一些结构很相似的底物。绝对专一性：只能作用于某一底物。专一性•酶的专一性是指在一定的条件下，一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型反应的特性。•1．绝对专一：只催化一种底物进行快速反应，甚至是立体专一性•2相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。基团专一和键专一酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH值、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。在酶的应用过程中，必须控制好各种环境条件，以充分发挥酶的催化功能。(六)影响酶催化的各种因素底物浓度的影响•在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速度与底物浓度成正比，反应速度随着底物浓度的增加而加快。当底物浓度达到一定的数值时，反应速度的上升不再与底物浓度成正比，而是逐步趋向平衡。[S]VVm酶浓度的影响•在底物浓度足够高的条件下,酶催化反应速度与酶浓度成正比反应速度酶浓度温度的影响•每一种酶的催化反应都有其适宜温度范围和最适温度。在最适温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。反应速度温度pH值的影响•酶的催化作用与反应液的pH值有很大关系,每一种酶都有其各自的适宜pH值范围和最适pH值。反应速度pH抑制剂的影响•酶的抑制剂：使酶的催化活性降低或者丧失的物质。•抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆抑制剂之分。•不可逆抑制剂：与酶分子结合后，抑制剂难于除去，酶活性不能恢复。•可逆性抑制剂：与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。•根据可逆性抑制作用的机理不同，酶的可逆性抑制作用可以分为竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制三种。抑制剂的影响•竞争性抑制：指抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用。•机制：竞争性抑制剂与酶作用底物的结构相似。它与酶分子结合以后，底物分子就不能与酶分子结合，从而对酶的催化起到抑制作用。•例如，丙二酸是琥珀酸的结构类似物。丙二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。•竞争性抑制的特点：是酶催化反应的最大反应速度Vm不变，而米氏常数Km增大。抑制剂的影响•非竞争性抑制（noncompetitiveinhibition）：指抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合，而引起酶活性降低的抑制作用。•机制：由于非竞争性抑制剂是与酶的活性中心以外的位点结合，所以，抑制剂的分子结构可能与底物分子的结构毫不相关。增加底物浓度也不能使非竞争性抑制作用逆转。•非竞争性抑制的特点：最大反应速度Vm减小，而米氏常数Km不变。抑制剂的影响•反竞争性抑制(uncompetitiveinhibition)：在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用。•机制：反竞争性抑制剂不能与未结合底物的酶分子结合，只有当底物与酶分子结合以后由于底物的结合引起酶分子结构的某些变化，使抑制剂的结合部位展现出来，抑制剂才能结合并产生抑制作用。所以亦不能通过增加底物浓度使反竞争抑制作用逆转。•反竞争性抑制的特点：最大反应速度Vm和米氏常数Km同时减小。激活剂的影响•酶的激活剂或活化剂：能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来的物质。•常见的激活剂有Ca++、Mg++、Co++、Zn++、Mn++等金属离子和Cl-等无机负离子。•例如，氯离子（Cl-）是α-淀粉酶的激活剂，钴离子（Co+2）和镁离子（Mg+2）是葡萄糖异构酶的激活剂等。•有的酶也可以作为激活剂，通过激活剂的作用使酶分子的催化活性提高或者使酶的催化活性显示出来。酶的生产方法提取分离法(Extraction)生物合成(Biosynthesis)化学合成(chemicalsynthesis)SOD-bloodPapain-PapayaChymotrypsin-Pancrea……organ/tissue/cellAmylasefromBacillusProteasefromBacillusPhosphatasefromBacillusGlucoamylasefromAspergillus……PlantcellcultureAnimalcellcultureFewexample五大要素：碳源、氮源、无机盐、生长因子、水培养基几乎是一切对微生物进行研究和利用工作的基础培养基（medium）是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。任何培养基都应该具备微生物生长所需要五大营养要素微生物发酵产酶•优良的产酶微生物具备的条件：•（1）酶的产量高；•（2）产酶稳定性好；•（3）容易培养和管理；•（4）利于酶的分离纯化；•（5）安全可靠、无毒性等。构成细胞物质和代谢产物中氮素（不能用作能源）氮源有机氮源蛋白胨、酵母膏、牛肉膏无机氮源铵盐、硝酸盐参与酶的组成、构成酶活性基、激活酶活性维持细胞结构的稳定性调节细胞渗透压控制细胞的氧化还原电位有时可作某些微生物生长的能源物质常用：硫酸盐、磷酸盐、氯化物以及含有钾、钠、钙、镁、铁等元素的化合物。氮源无机盐需要注意合适的碳氮比实验室的常用培养基：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基（或简称普通肉汤培养基）；放线菌：高氏1号合成培养基培养；酵母菌：麦芽汁培养基；霉菌：查氏合成培养基；例如枯草芽孢杆菌：一般培养：肉汤培养基或LB培养基；自然转化：基础培养基；观察芽孢：生孢子培养基；产蛋白酶：以玉米粉、黄豆饼粉为主的产酶培养基；1、酶生物合成的模式细胞在一定条件下培养生长，其生长过程一般经历调整期、生长期、平衡期和衰退期等4个阶段通过分析比较细胞生长与酶产生的关系,可以把酶生物合成的模式分为4种类型。即同步合成型，延续合成型，中期合成型和滞后合成型。同步合成型酶的生物合成与细胞生长同步进行的一种酶生物合成模式。该类型酶的生物合成速度与细胞生长速度紧密联系，又称为生长偶联型。属于该合成型的酶，其生物合成伴随着细胞的生长而开始；在细胞进入旺盛生长期时，酶大量生成；当细胞生长进入平衡期后，酶的合成随着停止。大部分组成酶的生物合成属于同步合成型，有部分诱导酶也按照此种模式进行生物合成。例如米曲霉在含有单宁或者没食子酸的培养基中生长，在单宁或没食子酸的诱导作用下，合成单宁酶（tanaseEC3.1.1.20）。影响产酶的环境因素•发酵温度、PH、溶氧•诱导物•阻遏物•表面活性剂•产酶促进剂的使用延续合成型酶的生物合成在细胞的生长阶段开始，在细胞生长进入平衡期后，酶还可以延续合成一段较长时间。属于该类型的酶可以是组成酶，也可以是诱导酶。例如，在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果胶为单一碳源的培养基中培养，可以诱导聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）的生物合成。中期合成型该类型的酶在细胞生长一段时间以后才开始，而在细胞生长进入平衡期以后，酶的生物合成也随着停止。例如，枯草杆菌碱性磷酸酶（Alkalinephophatase，EC3.1.3.1)的生物合成模式属于中期合成型。这是由于该酶的合成受到其反应产物无机磷酸的反馈阻遏，而磷又是细胞生长所必不可缺的营养物质，培养基中必须有磷的存在。这样，在细胞生长的开始阶段,培养基中的磷阻遏碱性磷酸酶的合成，只有当细胞生长一段时间，培养基中的磷几乎被细胞用完（低于0.01mmol/L）以后，该酶才开始大量生成。又由于碱性磷酸酶所对应的mRNA不稳定，其寿命只有30min左右，所以当细胞进入平衡期后，酶的生物合成随着停止。滞后合成型此类型酶是在细胞生长一段时间或者进入平衡期以后才开始其生物合成并大量积累。又称为非生长偶联型。许多水解酶的生物合成都属于这一类型。属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成，主要原因是由于受到培养基中存在的阻遏物的阻遏作用。只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而使阻遏解除后，酶才开始大量合成。若培养基中不存在阻遏物，该酶的合成可以转为延续合成型。该类型酶所对应的mRNA稳定性很好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。理想的酶合成模式•酶所对应的mRNA的稳定性以及培养基中阻遏物的存在是影响酶生物合成模式的主要因素。其中，mRNA稳定性好的，可以在细胞生长进入平衡期以后，继续合成其所对应的酶；mRNA稳定性差的，就随着细胞生长进入平衡期而停止酶的生物合成；不受培养基中存在的某些物质阻遏的，可以伴随着细胞生长而开始酶的合成；受到培养基中某些物质阻遏的，则要在细胞生长一段时间甚至在平衡期后，酶才开始合成并大量积累。•在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的合成模式应是延续合成型。因为属于延续合成型的酶，在发酵过程中没有生长期和产酶期的明显差别。细胞一开始生长就有酶产生，直至细胞生长进入平衡期以后，酶还可以继续合成一段较长的时间。•对于其他合成模式的酶，可以通过基因工程\细胞工程等先进技术,选育得到优良的菌株,并通过工艺条件的优化控制,使他们的生物合成模式更加接近于延续合成型。回本节2、酶生产过程中细胞生长动力学•细胞在控制一定条件的培养基中生长的过程中,其生长速度受到细胞内外各种因素的影响,变化比较复杂，情况各不相同。•细胞生长动力学主要研究细胞生长速度以及外界环境因素对细胞生长速度影响的规律。1950年，法国的莫诺德(Monod)首先提出了表述微生物细胞生长的动力学方程。在培养过程中，细胞生长速率与细胞浓度成正比假设培养基中只有一种限制性基质，而不存在其他生长限制因素时，μ为