3.糖链结构测定及糖的提取分离

分子量及分子式的测定质谱分析测定分子量和分子式。苷类化合物一般极性较大，无挥发性，遇热气化时易于分解，采用电子轰击质谱(EI—MS)常常不能获得分子离子峰。现多采用化学电离质谱(CI-MS)、场解吸质谱(FD-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)等方法来获得分子离子蜂，尤其是ESI-MS及FAB-MS两种质谱法更是目前测定苷类分子量常用的方法。七、糖链结构的测定组成苷的苷元和单糖的鉴定将苷用稀酸或酶进行水解，使生成苷元和各种单糖苷元的结构鉴定在有关章节中逐一介绍。组成苷中糖的种类鉴定通常采用PC、TLC等方法对水解液进行鉴定。糖类的PC常用的展开剂大多为含水的溶剂系统，如正丁醇-醋酸-水(4:1:5)，EtOAc-吡啶-水(2:1:2)等，其Rf值与溶剂的含水量有关。七、糖链结构的测定苷中糖的数目的测定质谱：苷分子量-苷元分子量，求出糖的数目。核磁：氢谱中端基质子信号数(5ppm左右)，碳谱中端基碳信号的数目(90-112ppm)。七、结构的测定苷元和糖之间连接位置的确定13C-NMR：苷化位移规律，将苷和苷元的碳谱相比较。成苷后，α-C约+8ppm,β-C约-4ppm二维核磁共振谱(如HMQCCOSY及HMBC谱)等技术广泛用于确定连糖位置。七、结构的测定糖与糖的连接位置的确定全甲基化物进行甲醇解，分析其甲醇解产物。七、糖链结构的测定采用的方法通常是将这些甲醚化的单糖进行了TLC鉴定，并与标准品对照。近来亦有用GC-MS联用仪对其进行鉴定的报道。全甲基化甲醇解：七、糖链结构的测定七、糖链结构的测定如：已知某二糖甲醇解后得到下列产物，请推测该二糖的结构（连接位置）OOMeOMeMeOMeOOHOOMeOMeMeOH3COMe+1234561'2'3'4'5'6'OOHOHHOHOOOOHOHHOH3C1'6全甲基化甲醇解甲基化反应(1)Haworth法：用硫酸二甲酯和氢氧化钠(或碳酸钠、碳酸钾)，可使醇羟基甲基化。其缺点是甲基化能力较弱，如果欲进行全甲基化反应，必须进行多次反应才能达到目的，(2)Purdie法：用碘甲烷和氧化银为试剂(一般可在丙酮或四氢呋喃中进行)，可使醇羟基甲基化，但因氧化银具有氧化作用，只能用于苷的甲基化．而不能用于还原糖的甲基化。七、糖链结构的测定(3)Kuhn改良法：在二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加入碘甲烷和氧化银或硫酸二甲酯及氢氧比钡(或氧化钡)，在搅拌下进行甲基化。本法的缺点是反应较缓慢。(4)Hakomari法(箱守法)：二甲基亚砜(DMSO)，氢化钠，碘甲烷七、糖链结构的测定此法反应迅速、完全、无需特殊装置、可在室温下连续反应，是目前最常用的全甲基化方法。但因在反应中，所用二甲亚砜和NaH均呈强碱性，故分子中有酯键的苷类不宜用本法。七、糖链结构的测定酶水解转化糖酶--------水解β-果糖苷键麦芽糖酶--------水解α-葡萄糖苷键杏仁苷酶--------水解β-葡萄糖苷键,专属性较低纤维素酶--------水解β-葡萄糖苷键NMR谱法测定利用端基质子的偶合常数如：5ppm(1H,d,J=7Hz)为下面哪个结构？七、糖链结构的测定-苷键构型的确定OOHHOHOOHORHHHHH124365OOHHOHOOHHORHHHH124365betaalpha一、提取植物体内，苷类常与水解该苷的酶共存。提原生苷：先杀酶。常用的方法是在中药中加入CaCO3,或用甲醇、乙醇或沸水提取，同时提取过程中要尽量勿与酸或碱接触，以免苷类分解。提苷原：可利用酶活性八、糖及苷类的提取和分离八、糖及苷类的提取和分离化合物的极性•功能基的种类：(-COOH)(-OH)(–C=O)(-COOR)-O-(-CnHm)•极性功能个数•分子内氢键降低极性•化合物大小小分子的极性大于大分子的极性常用溶剂极性：水甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯氯仿乙醚己烷H2OMeOHEtOHCH3COCH3EtOAcCHCl3EtOEtCH3(CH2)4CH3流程图中药EtOHEtOH提取物减压回收EtOH浓缩物石油醚提取石油醚部分残留物（多为油脂）Et2O或CHCl3提取Et2O或CHCl3残留物提取物（苷元）EtOAc提取EtOAc提取液残留物（含单糖苷或含糖较少的苷）n-BuOH提取n-BuOH提取液（含糖较多的苷）八、苷类的提取和分离糖和苷的提取分离药材水水提液3倍量以上乙醇醇水溶液沉淀（苷）（多糖）多糖提取分离（一）提取水提得到的粗多糖水溶液，加入95%乙醇使含醇量达80%，4摄氏度静置过夜，多糖析出。减压抽滤，用95%乙醇洗至溶液无色。沉淀（多糖）挥干醇。（二）除蛋白这是至关重要的一步，由于蛋白是大分子，它的存在会干扰多糖的纯化。一般选用sevage法萃取或离心，多糖浓度为1mg/ml,氯仿-正丁醇比例通常在3:1-5:1之间，变性的蛋白质一般在两相交界处产生一条白色的带。（三）检测除蛋白前后用紫外分光光度计检测280nm（蛋白质）和260nm（核酸）下的吸收值，多糖浓度为0.4mg/ml对照验证除蛋白的效果。•(四)离子交换纤维素(DEAE-纤维素)进行初步分离一般选用DE-52型离子交换纤维素（二乙氨基乙基纤维素52）1柱的预处理加蒸馏水浸泡过夜，期间换几次水，每次除去细小颗粒，用0.5mol/LHCl溶液浸泡1~2h,蒸馏水漂洗至中性；再用0.5mol/LNaOH溶液浸泡1~2h,蒸馏水漂洗至中性。2洗脱样品浓度在20mg/ml左右。先用水洗脱，再用NaCl梯度洗脱，小试时的梯度应密集一些，0.05,0.1,0.3,0.5mol/L洗脱，每瓶8ml,10min左右一瓶即可。根据紫外检测的结果，再进行梯度的修改。3合并流分硫酸-蒽酮法结合紫外检测（1）硫酸-蒽酮试剂的配制称取0.1g蒽酮至容量瓶中，加少量浓硫酸，搅拌使其溶解，加浓硫酸至50ml摇匀，得0.2%的硫酸-蒽酮试剂，尽量现配先用。（2）方法馏分隔管检测，每管取0.5ml，在冰浴中加入2ml硫酸-蒽酮试剂，然后在沸水中煮10~15min,自来水冷却，放至室温。（3）紫外检测主要看610nm出吸收值，合并馏分。（五）凝胶G进一步纯化通常采用G-100或G-200不断进行纯化（六）纯度检测采用高效液相凝胶柱进行检测•调节免疫•抗肿瘤•抗炎•抗凝血•抗病毒•降血糖•降血脂等活性多糖生理活性