生物制品 质量标准内容及结构确证内容

生物技术药物的质控体系—质量标准研究内容检定方法、质控标准理化性质：外观（形状、颜色、气味）、pH均一性：纯度、浓度鉴别结构确证效价：生物学活性、免疫学活性残余杂质：产品、工艺、环境相关的杂质起草、制定《制造与检定规程》研究建立国家标准品或参考品重组蛋白质药物质量标准研究效价：生物学活性与比活性蛋白质纯度蛋白质含量理化性质鉴定（部分非常规）残余杂质安全性及其它项目一生物学活性及比活性测定(一)检测意义获取准确的效价信息，保证产品有效效价：有效性指标，反映药品效力生物学活性才能真实反映生物技术药效价原因：生物制品分子大、结构复杂、不稳定，使得重量与效价不一致生物制品技术药：~单位（U、AU、IU）（二）生物学活性测定方法分类1、动物基础的活性测定离体动物器官法：脑利钠肽的兔主动脉体内测定法：EPO的小鼠网织红细胞2、细胞基础的活性测定促细胞生长法：大多数细胞因子类抑制细胞生长法：细胞毒素、血管抑制剂间接保护细胞法：IFN保护WISH3、酶学基础的活性测定：重组酶类4、受体-配体、抗原-抗体结合基础的活性测定：抗原决定簇与活性中心常不一致（三）生物学活性测定方法选择1、细胞培养法＞离体器官法＞体内法2、细胞染色标记方法：MTT＞3H-Thymidine＞流式细胞仪（测细胞周期、凋亡）3、定量法＞半定量法＞定性法4、生物学活性不一定与临床药效类型一致工艺稳定、测生物活性特别复杂时，可替代。如rh-GH用HPLC（四）生物学活性测定（见药典附录ⅩC）1、样品：原液、成品2、方法：如上述（好好研究？？？？）3、标准：不同生物活性测定方法的规定标准测定方法规定标准动物基础的活性测定70%-130%标示量细胞基础的活性测定80%-120%标示量酶学基础的活性测定85%-115%标示量结合反应的活性测定85%-115%标示量（五）蛋白质药物的比活性（见分生实验册77页）？？？1、样品：原液2、定义与计算：比活性：单位重量蛋白的活性单位数（IU/mg)3、标准：不小于。。。IU/mg4、意义：1）真实反映有活性的蛋白质所占的比例厂家间、表达系统间、批间比较2）便于配制成品二蛋白质纯度检查样品：原液方法：必须采用二种方法测定非还原SDS-PAGE法HPLC法标准：纯度均须达到95%或98%以上非还原SDS-PAGE法测定纯度（见药典附录ⅣC）SDS-PAGE：据分子大小分离样品处理：样品不加β-ME或DTT二硫键未打开，反映单体、二聚体或多聚体情况染色方法与上样量银染:5ug（检测限为1-10ng）考马斯亮蓝R-250：10ug（检测限为0.1ug）定量方法：凝胶扫描标准：无明显杂带，纯度≧95%或98%HPLC法测纯度？？？（见药典附录ⅢB）分析柱：反相柱、离子柱、分子筛应尽量采用反相柱或离子柱应注明采用的分析柱性质上样量：5ug标准：出峰时间正确纯度：≧95%或98%三、蛋白质含量测定(见药典附录ⅥD)样品：原液、成品方法：*Folin-酚试剂法（Lowry法）：（见分生实验册67-73页）简便、灵敏、优先采用，灵敏度：5-100ug/ml*染色法（Bradford法）：考马斯亮蓝G-250，简便灵敏，25-200ug/mlBCA(二喹啉甲酸)法：操作简单，比Lowry法快4倍且更加方便，准确灵敏：20~200ug/ml，微量BCA的测定范围在0.5~10ug/ml。经济适用，抗试剂干扰能力比较强。紫外分光广度法：用于原液比活性计算和成品规格控制四、蛋白质药物理化性质鉴定（一）特异性鉴别试验1、样品：原液和成品2、方法：免疫印迹法WesternBlot、DotBlot3、标准：应该阳性（二）相对分子量测定1、样品：原液2、方法：还原型SDS-PAGE（见分生实验册51页、见药典附录ⅣC）、质谱法3、标准：1）理论值±10%范围2）批与批间一致（三）等电点测定（见药典附录ⅣD）1、样品：原液2、方法：IEF：常规等电聚胶电泳（见分生实验册55-57页）CE：毛细管电泳3、标准：1）有明显主带2）理论值±0.5pH范围3）批与批间一致（四）紫外吸收光谱分析（见药典附录ⅡA）1、样品：原液2、方法：紫外扫描3、标准：1）最大吸收波长与特征波长一致2）批与批间一致（五）肽图分析（非常规）（见药典附录ⅧE）1、样品：原液2、方法：溴化氰/胰蛋白酶裂解+HPLC/SDS-PAGE/CE/质谱法3、标准：1）有特征性图谱2）批与批间一致（六）氨基酸组成分析（非常规）1、样品：原液2、方法：HCl/NaOH水解（仅用于Trp测定）+氨基酸自动分析仪3、标准：1）与理论值一致2）批与批间一致（七）氨基酸序列分析（非常规）1、样品：原液2、方法：N末端：15个残基，Edman化学降解法，蛋白质全自动测序仪C末端：1-3个残基硫氰酸酯/羧肽酶降解法，RP-HPLC3、标准：1）与理论值一致2）批与批间一致（八）其它：二硫键、糖基化（非常规）五、残余杂质检测（一）宿主相关杂质宿主细胞蛋白含量：（见药典附录ⅨC）1、样品：原液、成品2、方法：双抗体夹心ELISA：用HAS作保护宿主蛋白标准品：中检所提供3、标准：1）大肠杆菌≤0.1%2）CHO≤0.05%宿主细胞DNA含量（见药典附录ⅨB）1、样品：原液、成品2、方法：DNA点印迹杂交法，地高辛标记DNA标准品：厂家提供3、标准：DNA含量≤10ng/剂量细菌内毒素含量（见药典附录ⅫE凝胶限量实验）1、样品：原液、成品2、方法：鲎试剂分析法鲎试剂标准品：中检所提供3、标准：内毒素含量≤1０ＥＵ/剂量（二）工艺相关杂质（见药典附录ⅨA）如残余抗生素、IgG、蛋白A、小牛血清（三）产品相关杂质如多聚体、不同的PEG修饰产物六、安全性及其它检测项目（一）无菌试验平皿法，需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体（二）热原试验鲎试剂法或家兔法（三）异常毒性试验小鼠（1ml)或豚鼠（5ml），腹腔注射（四）水分、装量、pH值原液质量标准生物学活性、比活性（见药典附录ⅩC）蛋白质含量(见药典附录ⅥD)纯度：≧95%，非还原SDS-PAGE法（见药典附录ⅣC）、HPLC法（见药典附录ⅢB）分子量：还原型SDS-PAGE法（见药典附录ⅣC）、质谱法外源性DNA残留量：≤10ng/剂量（见药典附录ⅨB）宿主蛋白残留量:≦0.1%，0.05%（见药典附录ⅨC）残余抗生素：不得检出（见药典附录ⅨA）细菌内毒素：≤10EU/剂量（见药典附录ⅫE凝胶限量实验）结构确证：等电点（见药典附录ⅣD）、紫外吸收光谱扫描（见药典附录ⅡA）、N末端15个氨基酸顺序、肽图（见药典附录ⅧE）、（氨基酸组成、）成品质量标准鉴别试验：免疫印迹法/斑点法，阳性物理检查：外观、可见异物、装量化学检定：水分、pH值生物学活性：标示量的%范围无菌检查：不得检出内毒素检查：≤10EU/剂量异常毒性检查：符合规定